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中国狂犬病流行现状及病毒P、M基因遗传进化研究

吴慧  
【摘要】: [研究背景] 狂犬病是由狂犬病病毒侵入人和所有温血动物中枢神经系统而引起的急性致死性的人兽共患烈性传染病,病死率几乎为100%。近年来我国狂犬病的发病率呈现逐年上升趋势,并出现狂犬病潜伏期变短的新流行特征,在部分地区已成为严重的公共卫生问题。目前有关狂犬病流行病学调查及病毒病原学特征的研究较多,但对狂犬病病原学的研究主要集中在N、G基因,有关P、M基因的报道相对较少。随着对狂犬病病毒研究的深入,人们发现病毒的基因突变和进化普遍存在,在P、M基因上也表现出了与原始毒株基因的显著差异。这种差异影响到了病毒的生物学功能,研究表明P基因上相关氨基酸位点的变异能够影响狂犬病病毒的转录、装配及致病力等生物学功能;M基因上某些功能位点的变异会对病毒的结构,宿主的免疫反应及病毒释放等方面产生影响。因此,进行P、M基因序列的研究对了解我国狂犬病毒的遗传特征、进化演变特征、毒力及致病性具有重要意义。本研究从分子水平上对这两个基因序列进行主要功能位点的比较分析、同源性分析和种系发生分析,探讨我国狂犬病病毒P、M基因病原学特征及进化特点;同时探讨这两个基因的上述特征与我国狂犬病高流行和疫情扩散趋势的关系,为制定狂犬病监测计划以及控制狂犬病蔓延的措施提供科学依据。 [研究目的] 1.了解1996-2009年我国狂犬病流行特征; 2.分析我国狂犬病病毒P、M基因的遗传特点、变异方向及进化规律等分子生物学特征,为深入研究狂犬病毒的分子结构和遗传进化提供基础数据。 3.探讨我国狂犬病病毒P、M基因遗传变异与我国狂犬病流行的内在关系。 [研究方法] 1.狂犬病疫情资料的整理和分析 对1996-2009年我国狂犬病疫情数据的进行汇总,通过Excel 2003对录入的数据进行整理与分析,了解1996-2009年我国狂犬病流行特征特征。 2.标本的收集 对1996-2009年14年间狂犬病发病率进行聚类分析,将我国狂犬病流行区域划分为高、中、低三种不同程度发病区域,收集不同流行区域狂犬病动物脑组织标本。 3.标本的实验室检测 对所收集的狂犬病动物脑组织标本提取RNA,制备cDNA文库,通过设计狂犬病病毒特异性巢式PCR引物扩增病毒P、M基因片段,对目的片段进行纯化回收和基因测序。 4.标本P、M基因序列的分析 (1)用ATGC软件进行序列的拼接和校对; (2)用ClustalX(1.8)软件进行多重序列比对分析,发现序列特征; (3)用BioEdit软件将长短不一的序列编辑为相同位置相同长度的序列; (4)用DNAStar(5.01版)软件包中的MegAlign软件,进行序列联配和多序列比对,生成核苷酸和氨基酸的序列同源性分析表,获得各个标本之间同源性关系数据; (5)用GeneDoc软件将文件中的核苷酸序列或氨基酸序列位置一一对应,逐行显示出来; (6)用MEGA(4.0版)软件中的Neighbor-Joining(NJ, Replications= 1000)Method绘制种系发生树。 [结果] 1.1996-2009年我国狂犬病发病率呈逐年升高趋势;病例男性多于女性,夏秋季高发;流行呈现从南部到北部、从高发地区向邻近的中低发地区蔓延的趋势。 2.来自8个省区共77个狂犬病标本的P基因长度均为894bp,编码区在1485~2475位;63个狂犬病标本的M基因长度为609bp,编码区在2481-3285位。P/M基因核苷酸序列同源性(80.2-100%/83.4-100%)与氨基酸序列同源性(85.2-100%/90.6~100%)均较高。 3.PP与LP主要作用区域前19aa都高度保守;特定的蛋白激酶磷酸化丝氨酸位点、PP与NP相互作用主要区域第209-216aa仅个别位点发生变化;PP第Ⅲ组标本在第56位毒力位点氨基酸残基区发生突变。 4.所测63个M蛋白在高变区10-22aa及相邻区段均发生了多个位点的变异;MP序列的第29位毒力相关位点氨基酸残基未发生变化;MP调节病毒RNA转录和复制功能的第58位氨基酸高度保守;MP在病毒晚期芽生过程中起调节作用的PPxY结构域未发生变化。 5.种系发生树分析显示,所测标本都属于基因I型狂犬病毒;来源于同一省区的病毒趋向于同一进化群,各群中交叉存在有邻省病毒标本;病毒标本在进化存在由西南地区向中东部地区传播流行的趋势;我国狂犬病病毒与东南亚、泰国毒株进化关系较近,具有共同的进化途径。 [结论] 1.我国1996-2009年人间狂犬病整体呈现持续增长的高发态势,地域流行趋势变化明显。 2.本研究发现狂犬病病毒流行株P、M基因核苷酸序列突变主要是同义突变;M基因比P基因更保守。 3.本研究发现狂犬病病毒流行株P、M基因序列在多处氨基酸位点发生变异,这些变异出现在功能结构域的内部或相邻区域。 4.本研究发现狂犬病病毒标本都属于基因I型狂犬病毒,具有中国地域特点。 5.病毒标本在进化上存在西南地区和中东部地区同时扩散的趋势,与我国2003-2009年间狂犬病流行的地域特征相吻合,我国狂犬病的流行与狂犬病病毒的分布和传播有直接关系。


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