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荧光定量PCR检测哈维氏弧菌活的非可培养状态过程中的基因表达

姜荧安  
【摘要】:哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是广泛存在于海洋环境中的一种发光性革兰氏阴性菌,也是引起海洋动物弧菌病的重要条件性病原菌,能够感染多种海洋脊椎动物和无脊椎动物。活的非可培养状态(Viable but nonculturable state,VBNC)指细菌处于不良环境时细胞缩成球形,用常规方法培养时不能生长繁殖,但仍然具有代谢活性及致病力的一种特殊存在形式。在适当条件下VBNC状态的细菌能够恢复为可培养状态。已有研究发现,哈维氏弧菌在低温寡营养条件下能够进入VBNC状态。本论文建立了检测哈维氏弧菌基因表达的荧光定量PCR方法,研究了热激和冷激条件下vhh、hsp、cysS、oppA、MnSOD和rpoS基因的表达,并进一步研究哈维氏弧菌从诱导进入VBNC状态到完成复苏的整个过程中,这几种基因表达的动态变化。 哈维氏弧菌SF-1置于40℃水浴中进行热激处理,处理时间分别为0min、10min、20min、30min、50min。对各处理样品进行荧光定量PCR的结果显示,hsp基因在热激处理时表达量明显增加,热激处理前期表达量的增加尤其显著。MnSOD基因在热激10min时表达量升高为原来的9.641倍,随后逐渐下降,到50min时其表达量大致恢复到正常水平。oppA基因的表达量随着热激时间的延长有明显下降趋势。vhh、cysS和rpoS基因的表达量在热激过程前期略有升高,随后明显下降。 哈维氏弧菌SF-1置于4℃冰箱中进行冷激处理,处理时间分别为Oh、1h、2h、4h、8h、12h。对各处理样品进行荧光定量PCR检测发现,在冷激处理过程中vhh基因和cysS基因的表达量呈下降趋势。ppA基因表达量没有明显的规律性。MnSOD、rpoS和hsp基因的表达在整个冷激过程中明显增加。 哈维氏弧菌SF-1接种在人工海水中进行低温(4℃)培养,结果发现它在低温寡营养条件下诱导84d时进入VBNC状态。应用荧光定量PCR的方法,对哈维氏弧菌VBNC状态诱导及复苏全过程中6个毒力相关和应激相关基因的表达水平进行动态检测。发现在低温诱导前期rpoS、cysS和vhh基因表达量均比正常状态增加,随着低温诱导时间的延长,3种基因的表达量逐渐减少,进入VBNC状态后rpoS、cysS和vhh基因的表达量分别下降为原来的0.037倍、0.055倍和0.232倍,复苏后rpoS基因表达量约为正常状态时的0.674倍,而cysS基因和vhh基因表达量则均恢复到正常水平。oppA和MnSOD基因表达量在低温诱导过程及进入VBNC状态后均呈下降趋势,复苏后这三种基因的表达量分别为正常时期的1.765倍、0.232倍和2.593倍。进入VBNC状态时毒力相关基因的表达量降低,但复苏后大多能恢复到正常水平,可能是哈维氏弧菌复苏后保持致病性的重要原因之一。


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