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产蛋白酶菌株HW08的鉴定及其所产胞外低温碱性蛋白酶Ps5的性质研究

杨成业  
【摘要】:从我国黄海底泥中分离得到一株产低温碱性蛋白酶的适冷菌,编号为HW08。通过对其进行形态特征观察,生理生化实验鉴定以及16S rDNA序列比对的研究,我们确定其为Pseudomonns lundensis种的成员。研究表明,该菌株为革兰氏阴性杆菌,宽1μm,长3-5μm,可借助一极生鞭毛运动,不产孢子,在紫外线的照射下菌落呈淡绿色。生长温度为4-33℃,最优生长温度为25℃。有氧代谢而不进行无氧发酵。 HW08菌分泌一种胞外的碱性低温蛋白酶,在经过发酵液离心,硫酸铵沉淀,超滤浓缩,凝胶过滤后,得到了电泳级纯的胞外蛋白酶,命名为Ps5。该酶的最适作用温度为30℃,最适pH为10.4。Ps5为金属蛋白酶(其活性受EDTA显著抑制),聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,它的分子量为46KDa。 由Ps5最适温度为30℃,在0℃时还保持20%的活性可知,它属于一种低温酶。作为一种低温酶,Ps5在4℃保存60天,或经历反复的冻融(至少4次)后,活性没有明显的下降。在5 mM Ca2+存在的条件下,该酶显示出了较广泛的温度稳定性(25-40℃)和pH稳定性(7.0-11.0)。并且,该蛋白酶对洗涤添加剂,如非离子表面活性剂和漂白剂有一定的耐受性。这些特点使Ps5在工业应用中表现出一定的潜力。 另外,在研究金属离子对酶的影响时我们发现,与大多金属蛋白酶不同的是:Ps5的活性受到Zn2+、Ca2+的抑制,而不是被它们的激活。结合Ps5较显著的稳定性(尤其在Ca2+存在时),我们推测这一特性应该与此酶的催化机制有关,其特殊作用机制值得进一步深入研究。 使用鸟枪法克隆Ps5的基因,但没有筛选到阳性克隆。实验室通过PCR的方法得到了Ps5基因,有着完整的ORF阅读框。但在大肠杆菌当中无法表达出活性蛋白,我们认为这是因为Ps5的活性表达需要其上下游基因的共同参与,其分泌机制属于所谓ABC策略。Ps5上下游基因正在克隆中。


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