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《中国海洋大学》 2010年
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海带和菲律宾蛤仔提取物对酪氨酸酶活性和黑素生成影响的研究

徐睿  
【摘要】:酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)是一种含铜的氧化还原酶,广泛存在于生物体中,是生物体合成黑色素的关键酶,筛选天然来源的酪氨酸酶抑制剂,可以为美白化妆品或以酪氨酸酶为作用靶点的药物开发提供依据。 本研究对15种海洋藻类和5种海洋动物进行了酪氨酸酶抑制活性的筛选,结果表明海带和菲律宾蛤仔提取物对酪氨酸酶有明显的抑制作用。通过正交试验确定了这两种海洋生物提取物的最佳提取条件,系统研究了提取物对酪氨酸酶的抑制效果和作用机理,评价了其抗紫外线催化作用等生物活性,相关研究内容及结果如下: 1.建立了筛选酪氨酸酶抑制剂的反应体系,确定以1.0mmol/L的多巴为底物,酶的终质量浓度为3.14mg/L,反应温度32℃,pH6.8,反应稳态时间为1min,以20%DMSO水溶液为测活提取物溶剂。依据建立的筛选体系,比较了15种海洋藻类和5种海洋动物提取物的酪氨酸酶抑制活性,发现海带提取物和菲律宾蛤仔提取物对酪氨酸酶抑制活性最强。 2.用传统浸提法对海带中的酶抑制成分进行提取,通过单次单因素实验与正交试验结合的方法对提取条件进行了优化。最佳提取条件为:乙醇浓度50%,提取温度40℃,提取时间为3h,料液比为1g:12mL。乙醇提取物经有机溶剂萃取,依次得到乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物和水溶性组分,酶活抑制实验表明:水溶性组分对酪氨酸酶有明显的抑制作用,其IC50约为0.16mg/mL。进一步动力学分析表明,水溶性组分对酪氨酸酶具有竞争性可逆抑制作用,抑制常数KI=0.07mg/mL。定性测定结果表明:水溶性组分中具有其他两种萃取物所不具备的酚类等物质,结合已有研究,初步判断水溶性组分中对酪氨酸酶起抑制作用的物质很可能是酚类。采用等毒法研究水溶性组分与熊果苷和曲酸的协同抑制作用,结果表明:水溶性组分与曲酸对抑制酪氨酸酶活性有协同作用。 3.对菲律宾蛤仔提取物的最佳提取条件为:乙醇浓度95%,提取温度50℃,提取时间为4h,料液比为1g:8mL。菲律宾蛤仔乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物和水溶性组分都具有较强的酪氨酸酶抑制作用,IC50分别为0.43mg/mL、0.63mg/mL、0.72mg/mL。进一步动力学分析表明,乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物对酪氨酸酶具有非竞争性可逆抑制作用,抑制常数分别为0.47mg/mL、0.71mg/mL。水溶性组分对酪氨酸酶具有竞争性可逆抑制作用,抑制常数为0.31mg/mL。联合抑制试验表明:乙酸乙酯萃取物与熊果苷对抑制酪氨酸酶活性有协同作用,水溶性组分与曲酸具有协同作用。 4.以海带提取物水溶性组分,菲律宾蛤仔乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物和水溶性组分作为待测物质,分别研究它们的抗紫外线催化作用,抗多巴自动氧化作用和促黑素分解作用,结果表明:四种组分均具有极显著的抗紫外线催化作用,另外海带提取物水溶性组分和菲律宾蛤仔石油醚萃取物具有显著的促黑素分解作用,海带提取物水溶性组分和菲律宾蛤仔提取物水溶性组分具有显著的抗多巴自动氧化作用。
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