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《中国海洋大学》 2010年
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耐冷酵母Guehomyces pullulans17-1菌株乳糖酶的研究

宋春丽  
【摘要】: 乳糖酶(β-D-半乳糖苷酶,β-D-galactoside-galactohydrolase, EC 3.2.1.23)为一种水解酶,可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,目前广泛应用于医药、食品、环保等领域。冷适应乳糖酶具有在低温下高活性的优点,应用在乳品加工和乳清引起的环境污染治理等方面,有着中温和高温乳糖酶无法达到的优越性。同时南极地区被认为是一个潜在的、重要的微生物资源库,可能是产生新型生物活性物质和先导化合物菌株的潜在种源地。我们实验室从采集自南极的海泥样品中筛选到33株酵母菌,本实验在15℃条件下,采用X-gal定性试验和ONPG定量试验从这33株酵母中筛选产乳糖酶的菌株,结果筛选到1株高产乳糖酶菌株17-1,经酵母菌常规方法和分子生物学方法鉴定,我们将其鉴定为一株普鲁兰久浩酵母(Guehomyces pullulans)。 研究发现,G. pullulans 17-1菌株可同时产胞外和与细胞结合的(Cell-bound)乳糖酶,根据温度对菌体生长的影响,我们判定菌株17-1为一株耐冷型酵母。对耐冷酵母G. pullulans 17-1菌株产乳糖酶的培养基及培养条件进行了优化,确定了最佳培养基成分为(w/v):乳糖3.0%,酵母粉0.7%,蛋白胨0.3%,紫苏油0.02%, KH2PO4 0.28%, MgSO4·7HO20.06%, MnSO4·3HO2 0.00085%,培养基初始pH为4.5,蒸馏水配制;最佳培养条件为:15℃、170 rpm振荡培养132 h,此时耐冷酵母G. pullulans 17-1菌株乳糖酶总产量可达13.9 U/mL。对发酵罐高密度发酵产酶条件进行了初探,实验结果表明可以将该乳糖酶的总产量提高到25.3U/mL。用粗酶样品水解乳糖溶液,水解产物为葡萄糖和半乳糖,水解牛奶可产生大量还原糖。 G. pullulans 17-1菌株胞外乳糖酶经超滤法浓缩、SephadexTM G-200凝胶过滤、CM-Sepharose F.F.阳离子交换层析得到了纯化,比活力提高2.4倍。SDS-PAGE显示其单亚基分子量约为170.0 kDa,用凝胶过滤层析法测得该纯化酶的分子量约为335.0 kDa,因此推测G. pullulans 17-1菌株乳糖酶是一个同源二聚体。对该纯化酶的酶学性质进行了研究,结果表明:其最适作用温度和pH分别为50℃和4.0,受Ag+、Hg2+的强烈抑制(8.2%,8.4%),Li+离子对它有一定激活作用,对底物ONPG的Km值和Vmax分别为3.3 mM和9.2μmol/min。一级蛋白质谱分析表明,该乳糖酶的一个肽片ALEEYKK与其它已知酵母乳糖酶序列相匹配。将纯化的乳糖酶和4.6%乳糖溶液混合,50℃下孵育4 h后,测得乳糖溶液的水解率为43.5%,实验结果表明该乳糖酶在食品工业中有潜在的应用价值。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q814

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【参考文献】
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