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《中国海洋大学》 2009年
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桔霉素三聚体Tricitrinol B的抗肿瘤活性及机制研究

刘红椿  
【摘要】: 极端环境中的微生物为了适应生存,逐步形成了独特的结构和生理机能,能够产生多种极端酶和其他生物活性物质,极端微生物资源是抗肿瘤药物重要的资源宝库。本论文首先对从火山口沉积物来源的桔青霉Penicillium citrinumHGY1-5中分离得到的一系列桔霉素衍生物进行初步的抗肿瘤活性筛选,发现结构全新的桔霉素三聚体Tricitrinol B具有较强的抑制体外肿瘤细胞生长的作用。本论文较为全面地评价了Tricitrinol B的体外抗肿瘤活性,并检测了其对拓扑异构酶的抑制作用,阐明Tricitrinol B是作为嵌入性的拓扑异构酶Ⅱ毒剂来发挥抗肿瘤作用的。 为了全面地评价Tricitrinol B的体外抗肿瘤作用,选取不同组织来源的17株细胞株进行细胞增殖抑制活性的检测,结果显示Tricitrinol B对各种组织来源的肿瘤细胞株和正常细胞株HMEC均表现出普遍的细胞毒作用,其平均IC50值约为4.77μM。同时检测Tricitrinol B对两株p-糖蛋白过表达的多药耐药细胞株(KB/VCR和MCF-7/ADM)的细胞毒作用,发现Tricitrinol B对2株多药耐药细胞及相应的亲本细胞株表现出同等程度的生长抑制作用,平均耐药因子(RF)约为1,显著低于阿霉素(ADR)和长春新碱(VCR)的RF,表明Tricitrinol B具有良好的抗多药耐药作用。进一步采用DNA Ladder方法证实凋亡是TricitrinolB诱导细胞死亡的方式;采用AnnexinⅤ-FITC方法发现化合物Tricitrinol B诱导HL60细胞凋亡具有明显的浓度和时间依赖性,其在12h时主要诱导细胞发生早期凋亡,24h主要发生晚期凋亡;采用JC-1方法发现Tricitrinol B可以浓度和时间依赖性地降低细胞膜线粒体膜电位;利用Western Blot检测Tricitrinol B对凋亡关键蛋白的影响,发现其可以激活凋亡相关蛋白caspase-8、Bid、caspase-3和PARP蛋白,引起不可逆的细胞凋亡;运用凋亡抑制剂发现Tricitrinol B诱导的细胞凋亡主要依赖死亡受体通路来实现。 在此基础上,本论文对Tricitrinol B的抗肿瘤机制进行了深入研究。DNA拓扑异构酶(topoisomerase, Topo)具有重要的细胞生物学功能,已经成为抗肿瘤药物重要的作用靶点。本论文应用多个无细胞体系和细胞体系模型对Tricitrinol B的Topo抑制作用进行多方位和多层次的研究和确证,以阐明Tricitrinol B抑制TopoⅡ的具体机制。PBR322解螺旋实验显示Tricitrinol B能抑制TopoⅠ的催化活性,但DNA切割实验和In vivo Complex of Enzyme(ICE)实验均表明Tricitrinol B不能稳定TopoⅠ-DNA可切割复合物,提示Tricitrinol B的作用机制不同于喜树碱类化合物,Tricitrinol B对TopoⅠ的抑制作用可能是一种非特异性的抑制作用。与此形成对比的是,PBR322解螺旋反应和kDNA去连环实验均表明Tricitrinol B能够剂量依赖性地抑制TopoⅡ的活性;ICE实验进一步证明Tricitrinol B能够稳定TopoⅡ-DNA形成的可切割复合物TricitrinolB还能诱导HL-60细胞DNA双链断裂并诱导DNA双链断裂分子标志y-H2AX蛋白水平升高;利用RNA干扰技术,发现下调TopoⅡα可以降低Tricitrinol B对细胞的凋亡诱导能力。这些结果表明Tricitrinol B是新型TopoⅡ毒剂,TopoⅡ是Tricitrinol B的作用靶点。 为了探讨Tricitrinol B发挥抑制TopoⅡα的具体机制,本论文进一步观察Tricitrinol B对TopoⅡ的各个催化环节的影响。首先,DNA伸展实验和溴化乙锭取代实验显示Tricitrinol B能够嵌入DNA;其次,DNA迁移实验表明TricitrinolB能够抑制TopoⅡ与DNA的非共价结合;再次,利用DNA切割/再连接实验证明Tricitrinol B能增强TopoⅡ对前链和后链DNA的切割,也能抑制前链和后链DNA的再连接,而且Tricitrinol B对后链的切割/再连接作用要强于对前链的切割/再连接作用,表明Tricitrinol B对前链和后链的作用有一定程度的选择性,这一作用与经典TopoⅡ抑制剂mAMSA的作用相似。以上研究显示,TricitrinolB作用如下环节:嵌入DNA结构,抑制酶与DNA的非共价结合,影响酶对DNA链的切割/再连接。 综上所述,本研究发现桔青霉来源的化合物Tricitrinol B具有较好的体外抗肿瘤活性,能够嵌入DNA抑制TopoⅡ与DNA的非共价结合,影响ToppⅡ介导的DNA链的切割/连接,特别是对后链的切割/连接的影响要强于对前链的切割/连接的影响,继而能够引起细胞内大量DNA双链断裂,诱导细胞凋亡。以上研究提示,Tricitrinol B是一个结构全新的嵌入性TopoⅡ毒剂,可通过进一步的修饰改造,增加其疗效,减少毒副作用,进行后续的研究开发。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R96

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