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《中国海洋大学》 2010年 博士论文
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皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(GLO)的研究

王嘉  
【摘要】: 本论文首先介绍了脊椎动物维生素C合成关键酶——L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(GLO)研究进展,包括脊椎动物中GLO的性质,影响脊椎动物GLO活性的因素,GLO在脊椎动物中的存在、分布以及与脊椎动物进化的关系。然后,通过分子生物学手段,围绕皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)是否具有GLO活性,是否具有VC合成能力这一主题进行了研究。主要研究内容包括:(1)皱纹盘鲍GLO基因的克隆和组织及不同发育阶段的表达;(2)饲料维生素C对皱纹盘鲍成鲍生长、各组织抗坏血酸含量以及GLO mRNA表达量的影响;(3)皱纹盘鲍VC缺乏条件下肝胰腺和肾脏差异表达cDNA文库的构建。研究结果总结如下: (1)皱纹盘鲍GLO基因的克隆和组织及不同发育阶段的表达。配制VC0.0 mg/kg的精制饲料,在室内流水养殖系统中,投喂初重为74.32±0.43 g,初始壳长为84.36±0.24 mm的皱纹盘鲍成鲍,养殖周期170天。以肾脏组织mRNA为模板,通过简并引物PCR法克隆GLO核心片段,通过RACE法调取基因全长。通过特异引物PCR和荧光实时定量PCR法确定皱纹盘鲍不同组织和不同发育阶段的表达。结果如下:获得了皱纹盘鲍GLO cDNA全长序列,包括1606个核苷酸,其中开放阅读框包括1365个核苷酸,编码一个由454个氨基酸组成的蛋白质,其氨基酸序列与脊椎动物的GLO序列有很高的同源性(48%),确定其为皱纹盘鲍GLO基因;GLO mRNA在包括肝胰腺、肾脏、外套膜、肌肉、鳃和血细胞等6个组织中都有表达;GLO mRNA在从担轮幼虫到幼鲍的7个发育阶段都有表达,并且相对表达量在上足分化幼虫中达到最高,呈现随幼体发育先升高后下降的趋势。本研究在国际上首次从无脊椎动物中克隆到GLO全长序列,证明皱纹盘鲍具有VC合成能力。 (2)饲料维生素C对皱纹盘鲍成鲍生长、各组织抗坏血酸含量以及GLOmRNA表达量的影响。配制VC0.0,70.3,829.8和4967.5 mg/kg的共4个水平的精制饲料,在室内流水养殖系统中,投喂初重为74.32±0.43 g,初始壳长为84.36±0.24 mm的皱纹盘鲍成鲍,养殖周期170天。结果表明,饲料中不同VC含量对皱纹盘鲍成鲍的存活率,增重率,贝壳日增长率等生长指标没有显著影响(p0.05)。皱纹盘鲍不同组织间抗坏血酸含量存在极显著差异(p0.01),鳃在各处理组均极显著的高于其他各组织(p0.01);而血清除在70.3mg/kg处理组显著低于外套膜(p0.05)外,其他均极显著的低于其他组织(p0.01);总体而言,皱纹盘鲍组织抗坏血酸含量为鳃肾脏、肝胰腺外套膜、肌肉血清。饲料中不同添加水平的维生素C对皱纹盘鲍各个组织抗坏血酸含量产生不同的影响,对肾脏、外套膜、鳃和血清抗坏血酸含量没有显著影响(p0.05);而对肌肉和肝胰腺抗坏血酸含量产生显著影响(p0.05):当饲料中维生素C含量达到4967.5 mg/kg时,肌肉中的抗坏血酸含量极显著的高于0.0 mg/kg处理组(p0.01),显著高于829.8 mg/kg处理组(p0.05);肝胰腺中的抗坏血酸含量显著高于0.0 mg/kg处理组(p0.05)。不同组织中两种看家基因β-actin和核糖体蛋白S9 mRNA的表达量均存在极显著差异(p0.01),总体而言,β-actin mRNA的表达量血细胞鳃、肌肉、外套膜、肾脏肝胰腺;核糖体蛋白S9 mRNA的表达量鳃血细胞、外套膜、肾脏、肝胰腺肌肉。不同饲料维生素C对皱纹盘鲍β-actin mRNA的表达量在肝胰腺、肾脏、肌肉和外套膜中不受饲料维生素C含量的影响(p0.05),但在鳃和血细胞中受饲料维生素C含量的影响(p0.05);核糖体蛋白S9 mRNA的表达量在肝胰腺、肾脏、肌肉、外套膜和鳃中均无显著影响(p0.05)。以核糖体蛋白S9为内参基因时,饲料维生素C对各组织中GLOmRNA相对表达量均没有影响(p0.05);以β-actin为内参基因时,除鳃之外的其他各组织中GLO mRNA相对表达量均不受饲料维生素C的影响(p0.05);在鳃中,O.Omg/kg处理组显著高于829.8mg/kg处理组(p0.05)。各组织间GLOmRNA相对表达量存在极显著差异(p0.01),总体而言,GLO mRNA相对表达量肾脏鳃血细胞、外套膜、肝胰腺肌肉。 (3)皱纹盘鲍VC缺乏条件下肝胰腺和肾脏差异表达cDNA文库的构建。配制了维生素C缺乏(0 mg/kg)和正常(4967.5 mg/kg)2个水平的精制饲料,在室内流水养殖系统中,投喂初重为74.32±0.43 g,初始壳长为84.36±0.24 mm的皱纹盘鲍成鲍,养殖周期170天。采用抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization, SSH),构建了维生素C缺乏条件下肝胰腺和肾脏组织差异表达cDNA文库。消减杂交效率分析显示,构建的2个差异表达cDNA文库中差异表达的基因分别至少被富集了25和25-10倍。从文库中随机挑选阳性克隆测序。在肝胰腺差异表达cDNA文库中,获得了63个基因片段。在肾脏差异表达cDNA文库中,获得了39个基因片段。这些片段有可能为VC缺乏条件下差异表达的基因,这些片段的获得为进一步从分子水平研究皱纹盘鲍VC代谢机理奠定基础。


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