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《中国海洋大学》 2010年
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土星拟威尔酵母WC91-2菌株嗜杀因子和β-1,3-葡聚糖酶的研究

彭莹  
【摘要】:分离纯化了海洋嗜杀酵母Williopsis saturnus WC91-2菌株的β-1,3-葡聚糖酶,经SDS-PAGE检验是分子量为47.5kDa的单一蛋白。纯化的β-1,3-葡聚糖酶水解海带多糖的产物是单糖和二糖,具有外切β-1,3-葡聚糖酶活性,没有嗜杀活性,其二级质谱结果证实所纯化蛋白为外切β-1,3-葡聚糖酶,含有序列YIEAQLDAFEKR。纯化的β-1,3-葡聚糖酶,其最适作用温度为40℃,50℃以下稳定;最适作用pH值为4.0,在pH 3-7.5之间较稳定;Ba2+、Ni2+和Li+对β-1,3-葡聚糖酶的活性具有显著的激活作用,Zn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、Fe3+、Fe2+、K+和Co2+对其酶活具有抑制作用,Hg2+、Cu2+、Mn2+和Ag+具有较强的抑制作用;蛋白抑制剂1,10-菲啰啉、EGTA、PMSF、EDTA、SDS和碘乙酸对其酶活均有抑制作用;纯酶的米氏常数Km值为3.07 mg/ml,Vmax值为4.02mg/(min*ml)。 分离纯化了海洋酵母WC91-2菌株的嗜杀因子,它是分子量为11.0 kDa的单一蛋白,纯化的嗜杀因子仍具有嗜杀活性,但不能水解海带多糖,没有β-1,3-葡聚糖酶活性。对于纯化的WC91-2嗜杀因子,当检测培养基中的NaCl浓度为10.0%(w/v)时对敏感酵母菌株WCY的抑菌圈直径最大;WC91-2嗜杀因子的最适作用温度为16℃,在0-30℃范围内稳定;最适作用pH值范围是pH 3-3.5,在pH 3.0-5.0范围内稳定。 克隆得到WC91-2嗜杀因子的基因,其ORF框全长为378个碱基,编码125个氨基酸,基因序列与W. saturnus var.mrakii嗜杀因子的基因序列最为相似,信号肽预测结果表明N-端19个氨基酸为信号肽,推导蛋白分子量为11.6 kDa,与分离纯化的WC91-2嗜杀因子的分子量基本上相同。 纯化的WC91-2β-1,3-葡聚糖酶对WC91-2嗜杀因子的嗜杀活性有抑制作用。通过纯化的嗜杀因子或者β-1,3-葡聚糖酶对海带多糖和敏感酵母WCY细胞的结合实验,推测β-1,3-葡聚糖酶与嗜杀因子竞争结合位于敏感菌株WCY细胞壁上的β-1,3-葡聚糖结合位点,从而导致嗜杀因子与细胞的结合程度降低,对细胞的作用减弱,抑菌圈变小,表现出β-1,3-葡聚糖酶对嗜杀因子的嗜杀活性产生了抑制作用,嗜杀因子的嗜杀活性下降的现象。WC91-2菌株的嗜杀因子不是通过水解细胞壁上的葡聚糖来杀死细胞的,也不直接作用于敏感酵母细胞的细胞膜,不能杀死敏感酵母WCY细胞的原生质体。推测WC91-2菌株嗜杀因子的初始结合位点很可能存在于敏感酵母细胞的细胞壁上,并且很可能是细胞壁β-1,3-葡聚糖。通过实验和电镜照片推测其杀菌机理为WC91-2菌株嗜杀因子的存在影响到了敏感酵母细胞内外的渗透压,细胞内压导致孔道形成,胞内物质在不完整的细胞壁脆弱部位喷出而造成细胞死亡。 利用简并引物PCR、反向PCR及RT-PCR扩增得到编码WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的WsEXG1基因及两侧部分基因共3153bp。基因WsEXG1的DNA序列为1254bp,没有内含子,在NCBI的登录号为FJ875997.2。基因WsEXG1编码417个氨基酸,经预测前15个氨基酸为信号肽,有两个N-糖基化位点,预测分子量为46.2 kDa,预测等电点为4.5。分析WsEXG1基因序列,推测出其启动子位于-28到-77的位置,含有一个TATA框,但是没有CAAT框,其终止子在+1386到+1401的位置含有序列AAGAACAATAAACAA。推导蛋白与Pichia anomala和Candida albicans的β-1,3-葡聚糖酶分别有66.9%和59.4%的相似度。分析表明此蛋白含有糖基水解酶第5家族特征IGLELLNEPL,并含有一个序列为NLCGEWSAA的片段,其中的Glu-310(E)被认为是催化亲核体。 利用pINA1317表达载体,将WC91-2菌株的WsEXG1基因在Yarrowia lipolytica Polh中成功进行了超表达,得到了一株β-1,3-葡聚糖酶活力较高的菌株1317-G80。纯化了重组β-1,3-葡聚糖酶,并对重组酶进行了Western blotting鉴定。SDS-PAGE显示纯化的重组β-1,3-葡聚糖酶的分子量约为46 kDa。对于纯化的重组β-1,3-葡聚糖酶,其最适作用温度为40℃,40℃以下稳定;最适作用pH为5.0,pH 5.0-9.5之间稳定;Ba2+对其酶活有激活作用,Co2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Cu2+、Ag+、Ni2+对其酶活有抑制作用,其中Ag+、Hg2+和Fe3+表现出较强的抑制作用,Mg2+、Ca2+、Na+、K+、Li+、对酶活影响不大;蛋白抑制剂碘乙酸、EDTA、EGTA、PMSF、1,10-邻菲罗啉和SDS对其酶活有抑制作用;对于海带多糖的Km值为3.95mg/ml,Vmax值为2.3 mg/(min*ml)。重组β-1,3-葡聚糖酶能够将海带多糖水解成单糖,具有外切β-1,3-葡聚糖酶活性。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q93

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