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《中国海洋大学》 2010年
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海洋季也蒙毕赤酵母重组菊粉酶及其在产乙醇中的应用

张曈  
【摘要】: 菊粉(inulin)作为一种贮藏性碳水化合物存在于菊芋(Jerusalem artichoke)、菊苣(chicory)、大丽花(dahlia)和雪莲果(yacon)等植物的根和茎中,这些植物的根和块茎的产量很大,干重中含有超过70%的菊粉。菊粉(Inulin)是由β-2,1-糖苷键连接的D-呋喃果糖分子组成的链状大分子,在还原末端有一个葡萄糖残基以蔗糖型糖苷键连接。菊粉作为一种应用于高果糖浆生产,酒精发酵和寡菊糖生产的可再生原料,近来受到越来越多的关注。菊粉酶(Inulinase)是一种水解酶,它作用于β-2,1糖苷键并将菊粉水解为果糖和葡萄糖。 我们发现,从海藻表面分离得到的季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)菌株1(中国海洋微生物菌种保藏中心编号2E00048)能向培养液中分泌大量的菊粉酶。我们将海洋季也蒙毕赤酵母strain1中克隆到的菊粉酶基因INU1在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) X-33中表达,并优化了产酶条件,实现了菊粉酶的超表达。产酶条件优化之后,在72 h 150.0 mL摇瓶培养之后,在培养液上清中得到79.8±3.5 U/mL重组菊粉酶;经过120 h 2-L发酵罐发酵之后,在上清中获得286.8±5.4 U/mL(比活力8873±55.3 U/mg)的重组菊粉酶。随后我们纯化了重组菊粉酶并研究了它的酶学性质。纯化的重组菊粉酶的分子量为57.6kDa,大于野生型菊粉酶。它的最适pH值和最适温度分别为6.0和60℃。纯化的重组菊粉酶的其他生物化学性质与海洋季也蒙毕赤酵母中的野生型菊粉酶相一致。纯化的重组菊粉酶依然具有很高的外切活性,因此在食品和医药工业中具有广泛的潜在应用价值。 我们已经证实,酵母菌株W0能够发酵生产高浓度的酒精,但是W0不能直接利用菊粉作为发酵产酒精的原料。因此我们使用2-L发酵罐发酵得到的重组菊粉酶的粗酶液糖化菊粉,作为W0发酵酒精的原料。经过150.0 mL小发酵瓶和1-L发酵体系的菊粉水解液发酵实验,分别获得14.9±0.4%(v/v)和14.8±0.2%(v/v)的酒精产量。发酵液中的总糖和还原糖的残留极少,说明菊粉已全部被水解并转化为酒精。为了简化酒精发酵工艺,我们对酵母菌株WO进行了代谢改造,将海洋季也蒙毕赤酵母strain1中克隆到的菊粉酶基因INU1在酵母菌株WO的尿嘧啶缺陷突变株W101中表达。转化子Inu-66经过72h的培养能分泌33.7±0.4 U/mL的胞外菊粉酶。我们通过菊粉一步发酵产酒精的实验发现,重组酶接种量为22.8 U/g菊粉时最适合菊粉的水解和酒精的发酵生产。在150.0 mL体系中,酒精产量为13.7±0.5%(v/v),总糖利用率为99.1%。在2-L发酵罐中,酒精产量为14.9±0.6%(v/v),总糖利用率为99.5%,发酵培养基中的菊粉都转化为了酒精、CO2和细胞生物量。使用重组子Inu-66在2-L发酵罐中直接发酵菊芋粉和硫酸铵配制的发酵培养基产酒精,酒精产量为12.1±0.3%(v/v),总糖利用率为90.4±0.5%(w/v),残留还原糖含量为0.05±0.01%(w/v)。这个结果表明菊芋中所含有的总糖不全是可以被重组子Inu-66利用的菊粉,还有一些无法被水解的多糖。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TQ223.122

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