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《中国海洋大学》 2010年
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转鲑鱼降钙素基因酵母的发酵条件优化及安全性评价

陈云松  
【摘要】:降钙素是一种由32个氨基酸组成的多肽类激素,其蛋白结构的N端为二硫键,C端为脯氨酰胺基团。它在哺乳动物中起源于甲状腺C细胞,在鱼类中后腮体分泌。现在临床上广泛使用的是合成的人、鲑鱼降钙素,天然来源的猪降钙素和鳗鱼降钙素类似物,主要用于骨质疏松、高钙血症、变形性骨炎及类风湿性关节炎的治疗。由本实验室姜勇构建的转鲑鱼降钙素基因酵母yAGA2-r-sCT经实验证明具体内生物活性,这为开发鲑鱼降钙素的口服途径创造了可能,在生产上具有较大的应用潜力。为了提高发酵产量,我们对转鲑鱼降钙素基因酵母的发酵条件进行了优化,并通过动物毒理学实验对其进行了安全性评价,为实现降钙素的口服应用提供了实验数据。 转鲑鱼降钙素基因酵母发酵条件的优化包括对实验用酵母培养基的改良、外界培养条件的优化、工业用培养基组成及其诱导条件的优化:(1)以豆粕水解液作为氮源,采用正交设计方法,得出转基因酵母改良增殖培养基配方为:6%豆粕水解液,3%葡萄糖,0.5%酵母提取物,1%蛋白胨,pH 5。(2)通过单因素实验,对影响酵母生长的外界条件包括温度、发酵时间、接种量、搅拌转速和通气量进行优化,得出优化条件为:温度28℃,搅拌转速为200 rpm,通气量为8 L/min,接种量为8%,培养时间为3天。(3)采用部分因子设计筛选出显著影响转基因酵母生长的因子为豆粕水解液、葡萄糖和NaCl,并利用最速上升实验确定了这三个因子接近最大响应值所在的区域,最后结合响应面分析法得到了转基因酵母工业用增殖培养基最佳优化组合为:86.5g/L豆粕水解液,56.8g/L葡萄糖,1.10 g/L NaCl,5.0g/L K2HPO4,0.6 g/L (NH4)2SO4,0.2g/L MgSO4。(4)采用流式细胞和ELISA检测,通过对影响酿酒酵母表达鲑鱼降钙素蛋白的多个因素,包括诱导起始浓度、诱导时间、半乳糖浓度和添加方式的研究,结果表明:转鲑鱼降钙素基因酵母采用摇瓶发酵培养时,起始OD为0.8,诱导时间为12 h,半乳糖浓度为2%且一次性添加的方式下,外源蛋白的表达量达到5.92%。 以大鼠和小鼠为实验对象对表达鲑鱼降钙素的转基因酵母进行了毒理学实验,包括急性毒性实验、遗传毒性实验(小鼠骨髓微核实验、小鼠精子畸形实验)传统致畸实验、大鼠30天喂养实验和长期毒性实验。经口急性毒性实验显示LD5010.0g/k,表明转基因酵母属于实际无毒物质;遗传毒性实验结果显示小鼠红细胞微核率和精子畸形率与对照组相比没有显著差异,且无剂量-效应关系,表明转基因酵母不具有遗传毒性,没有致突变作用;传统致畸实验结果显示灌胃转基因酵母的孕鼠生长发育良好,对所产小鼠胚胎外观和胎鼠内脏和骨骼观察无致畸现象,表明转基因酵母没有对孕鼠产生母体毒性,对母鼠的生殖机能没有不良影响,对小鼠胚胎发育无致畸作用;30天喂养实验中大鼠增重、摄食量、血液和血液生化指标、脏器系数均在正常范围内,与对照组均无显著差异(P0.05),脏器组织切片检查未发现病理性变化;90天长期毒性实验结果显示,长期饲喂转鲑鱼降钙素基因酵母不会对实验动物产生毒副作用,最大无作用剂量在5.0 g/kg·BW以上,相当于人体推荐剂量0.8 g/kg·BW.因此转鲑鱼降钙素基因酵母未对实验动物造成不良影响,是安全无毒的。
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