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《中国海洋大学》 2010年
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壳寡糖及衍生物抗肿瘤作用、免疫调节作用及其机制的研究

曹秀明  
【摘要】: 占地球面积71%的海洋里生活着约40万种生物,占地球生物物种总数的80%。生长在海洋这一特殊环境(高盐、高压、缺氧、缺少阳光等)中的海洋生物,在其生长和代谢过程中,产生并积累了大量具有特殊化学结构并具有特殊生理活性和功能的物质,是开发新型海洋药物和功能食品的重要资源。 壳寡糖是甲壳素脱乙酰制得壳聚糖,再经降解得到的低分子聚糖,氨基葡萄糖是壳聚糖的单体糖。它显示出良好的水溶性和多方面的生物活性,一直是近些年来研究的一个热点。 本文通过体内体外实验对壳寡糖及其衍生物D-氨基葡萄糖盐酸盐(GlcNH2·HCl),N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)的抗肿瘤活性、免疫活性进行了研究。应用细胞形态学、流式细胞术、免疫化学及Western Blot方法和技术探讨了相关的作的机理。 实验结果表明,D-氨基葡萄糖盐酸盐在125μg/ml-1000μg/ml浓度范围内可以抑制胃癌细胞SGC-7901细胞的生长,最大抑制率达到63.2±2.5%、壳寡糖对SGC-7901抑制作用不明显。在这个浓度范围内GlcNH2·HCl对人肝癌细胞HepG-2也有一定的抑制作用,最大抑制率为36.8±2.4%。NAG对SGC-7901和HepG-2细胞生长没有抑制作用。体内实验表明GlcNH2·HCl在125 mg/kg-500 mg/kg剂量范围内可以抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长并延长H22荷瘤小鼠的生存时间,并有一定的保护免疫器官的作用。壳寡糖在65 mg/kg-125 mg/kg剂量范围内可以抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长并延长H22荷瘤小鼠的生存时间,并有保护免疫器官的作用。 在抗肿瘤机制研究的实验中观察到,GlcNH2·HCl处理后的SGC-7901细胞β-半乳糖苷酶表达增加,细胞发生衰老。荧光显微镜观察到D-氨基葡萄糖盐酸盐作用后的SGC-7901细胞形态,,部分染色质出现浓缩状态。可见凋亡小体形成,说明细胞发生了凋亡,流式细胞仪检测结果表明SGC-7901细胞周期被阻滞,G2/M细胞几乎为零。激光共聚焦显微镜观察到GlcNH2·HCl作用后,在不同时间观察SGC-7901细胞内钙离子浓度,发现各个实验组细胞内钙离子浓度明显高于对照组,趋势为24h48h72h,48h时,SGC-7901细胞内钙离子浓度达到最高。GlcNH2·HCl作用48h钙调神经磷酸酶的表达有升高,钙调神经磷酸酶的活性也有显著升高。而CyclinB1的表达量下降。流式细胞仪检测到细胞内活性氧(ROS)和细胞色素C浓度也明显高于对照组,线粒体膜电位下降,说明GlcNH2·HCl通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞增殖,其机理为细胞内钙离子浓度升高,激活钙信号通路调控细胞周期的进程,使细胞周期阻滞于S期,损伤线粒体,降低线粒体膜电位,升高细胞内活性氧浓度,Caspase-3活性增加,诱导细胞凋亡。 在壳寡糖及其衍生物免疫活性的研究中发现100μg/ml—50μg/ml浓度的壳寡糖能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力(P0.01)。对巨噬细胞产生NO、和TNF-a水平均有明显的促进作用。而GlcNH2·HCl和NAG在50μg/ml—200μg/ml浓度范围对巨噬细胞的吞噬能力和产生NO、和TNF-α与对照组相比没有显著差异。GlcNH2·HCl、NAG在浓度范围50μg/ml—200μg/ml内能够激活淋巴细胞,促进T淋巴细胞增殖,诱导T淋巴细胞进入S期。但COS对淋巴细胞增殖没有促进作用。GlcNH2.HCl、NAG作用体外分离的T淋巴细胞2h、4h、6h、24h后,淋巴细胞内的Ca2+浓度均显著高于对照组。其中加药6h后淋巴细胞内的Ca2+浓度最高。24小时后有所下降。GlcNH2.HCl、NAG作用于淋巴细胞72小时后,钙调蛋白表达,钙调神经磷酸酶表达增加,淋巴细胞分泌的IL-2也高于对照组。上述结果说明COS、GlcNH2·HCl和NAG对细胞免疫有不同的调节作用,壳寡糖对巨噬细胞具有调节作用,而GlcNH2·HCl和NAG能够通过激活T淋巴细胞Ca2+信号通路使之发生增殖增殖,并分泌信号物质IL-2。 综上所述,COS和GlcNH2·HCl有明显的抗肿瘤作用和免疫调节作用,这种双重作用有利于肿瘤患者的治疗和康复。NAG对淋巴细胞的功能也有一定的调节作用,但没有抗肿瘤作用。本研究为进一步应用壳寡糖、D-氨基葡萄糖盐酸盐和N-乙酰氨基葡萄糖提供依据。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285

【引证文献】
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