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《中国海洋大学》 2010年
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几种海洋动物酸性多糖的结构和活性研究

陈士国  
【摘要】:肝素用于预防和治疗血栓性疾病已有数十年的历史,但由于较大的出血副作用而限制了其临床应用。而且近年来发生的肝素污染事件也迫使人们寻找新的肝素类候选药物。 当前研究者更有兴趣从非哺乳动物来源制备治疗性药物,以减少病原体污染的危险性,而来自海洋的天然酸性多糖是肝素类候选药物的重要来源。本文选取了多种海洋动物多糖,包括海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯以及鱿鱼墨多糖,采用质谱、核磁等技术对其寡糖和多糖的结构进行分析,并探讨了它们的抗凝抗栓等活性。本文主要研究内容有以下几个部分: 1)采用质谱为主并结合核磁共振和甲基化技术对海参硫酸软骨素类似多糖—鱿鱼墨多糖的结构进行了确证。从北太平洋鱿鱼墨囊中分离纯化得到鱿鱼墨多糖SIP并采用负离子模式下的二级CID-MS-MS技术分析了酸降解鱿鱼墨寡糖的结构序列,结果表明这些寡糖具有一个三糖为基本结构序列的重复单位。结合核磁共振和甲基化技术,对糖的构型和连接方式进行了确证,得并出鱿鱼墨多糖SIP的结构为-[3GlcAβ1-4(GalNAca 1-3)Fuca 1]n-。得到子一个非常有用的0,2A系列离子碎片,并应用到归属它对归属4-连接的Fuc和GalNAc以支链连接的方式与Fuc。本部分建立了质谱法解析寡糖结构的方法,为进一步研究海参寡糖结构奠定理论基础。 2)核磁共振技术比较四种海参硫酸软骨素和岩藻聚糖硫酸酯的结构。以4种不同种类和不同生长海域的海参为研究对象,分离纯化获得4种海参硫酸软骨素(SC-CHS)和海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC),对其进行系统了生化性质分析。结果表明所有SC-CHS的组成单糖在种类上为类硫酸软骨素的特征,主要由葡萄糖醛酸(GlcUA)、氨基半乳糖(GlaN)和岩藻糖(Fuc)构成,它们之间的摩尔比约为1:1:1,但是呈现一定的种间差异,而硫酸基:葡萄糖醛酸的含量在2.6-3.1。首次采用1HNMR分析比较了四种SC-CHS的结构特征,不同SC-CHS的岩藻糖异头氢存在一定差异,根据SC-CHS硫酸酯化岩藻糖支链上异头氢信号特征,可以将岩藻糖支链硫酸基取代类型归纳为3种类型:1)寒带海域海参,以2,4-di OSO3双取代为主,并存在在非常独特2,4-di OSO3取代;2)温带海域海参,以2,4-di OSO3取代为主,含部分4-OSO3取代;3)热带亚热带海域海参,以4-OSO3为主,并含有其他硫酸基取代方式。13CNMR和二维核磁COSY, TOCSY对所得的结构进行确证。1HNMR可以作为鉴别海参中多糖品质差异的工具。 SC-FUC仅有岩藻糖组成,含有不同含量的硫酸基。经1HNMR分析比较,不同SC-FUC中岩藻糖残基的取代情况也存在较大差异,也可以作为初步鉴定海参品种的备选工具,但是有待于进一步的研究。 3)质谱结合核磁技术分析美国肉参岩藻聚糖特异性酸降解寡糖的结构。以美国肉参岩藻聚糖硫酸酯为研究对象,采用温和酸降解法制备其寡糖。首次发现了一种规律性酸降解的海参岩藻聚糖硫酸酯,酸特异性的作用于海参硫酸软骨素中非硫酸化岩藻糖(单元D)和第二个2,4-sulfated岩藻糖(单元A),且降解过程中未发生明显的脱硫酸基,这和05年mulloy等人报道的从海胆中的降解不一样,后者降解过程中2-SO4易发生脱硫酸基,并且酸的作用的岩藻糖单元的位置也不一样。分离纯化了所得的寡糖,并结合核磁和质谱技术进行了结构解析,得出美国肉参岩藻聚糖硫酸酯的结构为:[3-Fucp-a-(2,4SO4)-(1→3)-Fucp-a-(1→3)-Fucp-(2SO4)-a-(1→3)-Fucp-1→]n,为一种新的岩藻聚糖硫酸酯结构。 4)氧化降解法制备美国肉参岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖及寡糖的抗凝血活性分析。本部分研究了海参硫酸软骨素酸降解和氧化降解的机理。酸降解法易导致fCS-Ib支链岩藻糖基的脱落,且对主链氨基半乳糖的硫酸基也有影响,因此所得的低分子量组分不能准确反应fCS-Ib的结构和活性特点。而Cu2+催化的自由基作用于硫酸软骨素具有一定的选择性,主要作用葡萄糖醛酸C-2和C-3位点上,并且对支链岩藻糖和主链的氨基半乳糖的硫酸基取代都无影响,因此能够制备得含岩藻糖支链的寡糖。结合二维核磁和ESI-MS-MS的结果,对主要的寡糖组分的结构进行鉴定,最终推出美国肉参硫酸软骨素的结构为:-[3GalNAcp(4,6S)1-4GlcAβ(Fuca(2,4S)1-3)1]n-。并进一步的阐明了其自由基作用的机理。 5)海参多糖的抗凝血抗血栓活性研究。对四种海参硫酸软骨素的体外实验研究表明其抗凝血作用与支链岩藻糖硫酸基的取代方式相关,支链为2,4-S04取代的活性较好,而对美国肉参岩藻聚糖硫酸酯的抗凝分析表明其能显著延长APTT和TT,但是效果明显弱于海参硫酸软骨素多糖。对凝血因子抑制实验则表明海参硫酸软骨素主要通过抑制凝血因子FIIa发挥作用,其中HCII的抑制凝血酶活性强度明显高于标准肝素,说明海参硫酸软骨素主要通过抑制内源性凝血途径发挥抗凝血作用,2,4-O-disulfate双硫酸基取代的岩藻糖支链为主的美国肉参硫酸软骨素(fCS-Ib)抑制因子的活性明显强于以4-O-sulfate硫酸基取代的岩藻糖支链为主的菲律宾刺参硫酸软骨素(fCS-Pg)。美国肉参岩藻聚糖硫酸酯主要通过ATIII介导的抑制凝血因子FIIa发挥作用,此外还有显著的抑制因子FXa活性。体外血栓实验的结果则表明,海参硫酸软骨素的体外抑制血栓形成活性明显强于岩藻聚糖硫酸酯。海参硫酸软骨素中2,4-O-disulfate双硫酸基取代的岩藻糖支链为主的海参硫酸软骨素作用后的大鼠血液形成体外血栓明显轻于以4-O-sulfate硫酸基取代的岩藻糖支链为主的海参硫酸软骨素。 对美国肉参硫酸软骨素氧化降解所得寡糖的抗凝血活性进行研究。受试寡糖样品D1-D9I都有显著的延长APTT的效果,但是不能延长TT和PT。凝血因子实验的结果则表明抗凝血作用主要通过抑制内源性凝血因子FIIa来发挥作用,说明寡糖主要通过内源性凝血途径来实现抗凝血效果。美国肉参硫酸软骨素寡糖对凝血因子FIIa最小作用寡糖为一个七糖结构,结构为GalNAcOOHβ(4,6S)1-4GlcAp (Fuca(2,4S) 1-3)1-3GalNAcp(4,6S)-4GlcAp (Fuca(2,4S)1-3)1-3GalNAcp(4,6S),为一种潜在的抗凝抗栓寡糖药物。 6)海参类似多—鱿鱼墨多糖的硫酸酯化及硫酸酯化产物的抗凝血和抑制癌转移活性的研究。首次对结构独特的鱿鱼墨多糖进行硫酸酯化,并采用红外光谱和核磁共振技术解析出其主要结构为:-[3GlcAβ1-4(4,6-SO4-GalNAca1-3) Fuca1]n-.。进一步的凝血活性分析表明有较好的延长APTT和PT时间效果。对凝血因子的抑制实验则表明,硫酸化后的鱿鱼墨多糖TBA-1对FIIa和FXa均有显著的抑制作用。鱿鱼墨多糖还具有显著的抑制HepG2细胞转移和侵袭的活性,并且能够抑制CAM上血管新生。
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