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《中国海洋大学》 2010年
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大豆胰蛋白酶抑制剂的制备、理化性质和抗黄曲霉作用

张宾  
【摘要】:大豆乳清是工业上采用碱提、酸沉等工艺制备大豆分离蛋白的副产物。目前,我国每年排放的大豆乳清废弃液在300万吨以上,这既造成了大量的资源浪费又造成了环境的污染。而大豆乳清液中含有大量的功能性成分,如其中的胰蛋白酶抑制剂具有多种生理功能,在生物农药、医药等领域均有着广泛的应用前景。对于胰蛋白酶抑制剂的分离、纯化工作,目前仅在实验室水平上采取水浸、酸提、盐析、凝胶过滤层析等较为繁杂的方法纯化制得,耗时长、产率和纯度也不高;还有利用琼脂糖凝胶亲和纯化制得,但其材料价格昂贵且活化时具有较大毒性。 黄曲霉在自然界中分布很广,能侵染饲料、花生、油料等各种食物,而黄曲霉侵染后所产生的黄曲霉毒素是化合物中毒性最强的有害物质之一。目前,关于黄曲霉对食物浸染的控制研究还仅仅局限于采用通风、控制湿度和温度等物理方法,及添加有毒的化学抑菌剂等方法,而在花生、玉米及其他农产品中添加天然生物抑菌剂,以减弱黄曲霉侵染作用的研究还鲜有报道。。 本文利用壳聚糖、大豆及野生大豆为原料,将制备的壳聚糖树脂-胰蛋白酶亲和介质,应用于胰蛋白酶抑制剂的分离、纯化中,并研究胰蛋白酶抑制剂结构性质及其抗黄曲霉侵染活性,为开发控制花生、玉米等食品中黄曲霉毒素含量的生物制剂提供理论支持和应用基础。 1)壳聚糖树脂制备条件的优化:当壳聚糖溶液2.0%(w/v),搅拌速度300 r/min,戊二醛终浓度3.6%(v/v),还原剂NaBH4终浓度0.06 mol/l时,制备的壳聚糖树脂尺寸均一,球状规整,平均粒径约为416μm,适合于作为固定化酶的载体。经FTIR, XRD和DSC分析发现,交联反应主要是通过壳聚糖糖环上的氨基与戊二醛的醛基结合形成Shicff碱结构,连接分子间或分子内的壳聚糖分子进而形成球状的壳聚糖树脂。此外,戊二醛和NaBH4的添加量直接影响着制备树脂的孔度值、交联度及树脂表面的微观结构等。 2)壳聚糖树脂-胰蛋白酶制备条件的优化:以制备的壳聚糖树脂为载体,采用低毒、高效的环氧氯丙烷为活化剂,胰蛋白酶为偶联剂,制备了壳聚糖树脂-胰蛋白酶亲和介质。其最佳制备工艺条件为,环氧氯丙烷终浓度15%,活化温度60℃,偶联温度30℃,活化过程中加入适量的NaBH4和1,4-二氧六环。正是由于胰蛋白酶的固定化防止了蛋白肽链的折叠缠绕,保护了其三级结构或结构域不被过高的温度或环境所破坏,因此拥有较高的温度和pH耐受性,且具有良好的贮藏稳定性和操作稳定性。 3)胰蛋白酶抑制剂亲和纯化:采用盐析和等电点沉淀法从大豆及野生大豆乳清液中提取胰蛋白酶抑制剂粗品,然后以制备的壳聚糖树脂-胰蛋白酶为亲和介质进行一步亲和纯化,制得大豆胰蛋白酶抑制剂。纯化后的胰蛋白酶抑制剂经SDS-PAGE分析,呈现单一谱带,相当分子量为8.2 kDa,且亲和纯化倍数、比活力及活性回收率均较高。经其复合物分析、全水解氨基酸分析及氨基酸残基的化学修饰等方法证明,纯化制备的抑制剂属于Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂。 4)抗黄曲霉侵染活性:大豆及野生大豆胰蛋白酶抑制剂对黄曲霉生长具有较强的抑制活性,其IC50值分别为1.6μM和1.2州。当其浓度达到1.8μM时,可极大程度的抑制黄曲霉孢子萌发和菌丝体的生长。此外,通过黄曲霉分泌的α-淀粉酶和蛋白酶的活性及其对底物(淀粉、酪蛋白)的利用情况,发现抑制剂抑制黄曲霉生长的具体机理是通过抑制α-淀粉酶和蛋白酶的活性,进而限制黄曲霉分解碳水化合物所需营养物质的产生,阻断黄曲霉毒素的分泌和产生。 5)壳聚糖-胰蛋白酶抑制剂复合膜的制备及应用:以壳聚糖、胰蛋白酶抑制剂粗提取物为原料,甘油为增塑剂,即当壳聚糖浓度1.8%,抑制剂粗提取物浓度0.2%,甘油浓度1.2%,干燥温度45℃时,制备的复合膜具有较强抗黄曲霉活性。且复合膜表面及内部严紧致密,结构均一,分子间靠形成更多的氢键维持其稳定的结构。将该复合膜液涂膜于花生上,发现此复合膜对黄曲霉的侵染具有较强的抑制作用。 我国是世界花生的生产、消费和出口的主要国家,对于黄曲霉毒素污染问题目前仍无最佳防治技术。本研究在充分利用大豆乳清液资源和壳聚糖资源的基础上,采用制备的壳聚糖-胰蛋白酶亲和介质,纯化制备胰蛋白酶抑制剂,并将其粗提取物应用于花生的抗黄曲霉侵染中,为花生、玉米等谷物贮藏过程中的生物防治黄曲霉技术提供理论支持和具体应用基础。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TS201.25

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【引证文献】
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3 迟晨;海洋巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉毒素生物合成及其机制[D];中国海洋大学;2015年
4 刘丁;萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)抑制黄曲霉的作用研究[D];四川农业大学;2013年
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7 丁湄;改性壳聚糖树脂-Cu(Ⅱ)配合物的水解作用与应用[D];中国海洋大学;2012年
【参考文献】
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7 雷永;花生对黄曲霉菌侵染抗性的分子标记[D];中国农业科学院;2004年
8 段小华;花生黄曲霉抗性研究[D];华南师范大学;2004年
9 侯新东;红豆草胰蛋白酶抑制剂性质的研究(续)与一级结构的测定[D];新疆农业大学;2004年
【共引文献】
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1 车颖洁;郝林;;黄浆水发酵生产SCP的菌种选配[J];中国调味品;2017年03期
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3 崔丽;陈一新;梁吉艳;王新;王慧;孙晓航;;胺化羧甲基改性磁性壳聚糖的制备及吸附性能研究[J];工业水处理;2016年11期
4 车颖洁;郝林;;响应面法优化黄浆水发酵生产单细胞蛋白的工艺参数研究[J];中国酿造;2016年10期
5 宋欣欣;段小娟;徐颖;何晓霞;;豆类种籽中胰蛋白酶抑制剂研究进展[J];粮食与油脂;2016年06期
6 揭珍;徐大伦;胡小超;杨文鸽;邓思瑶;林娴萍;严小军;;大豆胰蛋白酶抑制剂对带鱼鱼糜蛋白降解及其凝胶特性的影响[J];核农学报;2016年05期
7 刘玲;梁海燕;;交联壳聚糖树脂吸附阿司匹林的动力学和热力学研究[J];食品工业科技;2016年15期
8 马立成;郑其;车小奎;冯海亮;严波;;Cu~(2+)印迹磁性壳聚糖微球的表征及吸附性能[J];高校化学工程学报;2016年01期
9 刘宇;张国治;黄纪念;宋国辉;董进;;絮凝-超滤处理豆制品废水研究[J];河南工业大学学报(自然科学版);2015年02期
10 汤卫华;王立晖;殷海松;孙勇民;;壳聚糖微球固定化β-半乳糖苷酶[J];食品与发酵工业;2015年05期
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1 郑海燕;挤压降解黄曲霉毒素B_1及作用机理研究[D];西北农林科技大学;2016年
2 马慧慧;寄生曲霉菌在不同饲料原料中产生黄曲霉毒素B_1的差异性及其机制研究[D];华中农业大学;2015年
3 朱英莲;阪崎肠杆菌免疫磁性富集及快速检测方法研究[D];中国海洋大学;2015年
4 廖家耀;AFT在“氧化铁—腐殖质-Pb~(2+)”系统中的吸附及土壤中AFT/Pb~(2+)检测的生物传感新方法[D];西南大学;2014年
5 徐霞;农产品中真菌毒素检测用新型光学纳米生物传感器的研究[D];浙江大学;2013年
6 刘亚平;采前喷布壳聚糖处理和采后适度失水处理对红地球葡萄保鲜效应研究[D];西北农林科技大学;2012年
7 刘炳杰;壳聚糖金属印迹树脂的制备、表征及吸附特性的研究[D];中国海洋大学;2012年
8 宋慧君;真菌毒素及潜藏性产毒真菌液相芯片多重测试方法的研究[D];沈阳农业大学;2012年
9 孙凤霞;三聚氰胺单克隆抗体制备及其高灵敏快速检测技术研究[D];江南大学;2011年
10 张道宏;黄曲霉毒素杂交瘤细胞株的选育及免疫层析检测技术研究[D];中国农业科学院;2011年
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1 王海斌;天津部分市场肉品中盐酸克伦特罗含量的调查与分析[D];吉林大学;2016年
2 王芳;蒙脱石对采食含霉变花生粕饲粮的肉仔鸡生产性能及健康的影响[D];甘肃农业大学;2016年
3 童晶晶;香芋蛋白的提取及其胰蛋白酶抑制剂的研究[D];华南理工大学;2016年
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7 雷会宁;大豆分离蛋白复合膜制备及应用研究[D];天津科技大学;2015年
8 杨运萍;不同基因型花生钙营养差异性研究[D];广东海洋大学;2014年
9 陈悦;壳聚糖/乳清蛋白/纳米TiO_2复合膜对鲜切雷竹笋的保鲜应用[D];武汉轻工大学;2014年
10 王锋棚;可食性复合膜的制备及在包装中的应用[D];天津科技大学;2014年
【同被引文献】
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1 郑兵福;李白玉;傅振华;胡欣欣;蒋立文;陈东明;;四棱豆油脂的脂肪酸组成测定[J];食品工业科技;2010年07期
2 刘飞;曾纬;尹定华;马开森;钟国跃;;人工冬虫夏草的氨基酸含量及其营养价值评价[J];氨基酸和生物资源;2009年04期
3 孙凤;彭颜晖;丁成丽;王强;;气相色谱-质谱法分析鹰嘴豆脂肪酸成分[J];医药导报;2009年11期
4 刘顺湖;周瑞宝;盖钧镒;;中国野生和栽培大豆蛋白质及油脂含量的比较分析[J];大豆科学;2009年04期
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8 徐杰,胡国华,张大勇;大豆种子脂肪酸组分的研究进展[J];大豆科学;2005年01期
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10 韩立德,盖钧镒,张文明;大豆营养成分研究现状[J];种子;2003年05期
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1 刘丁;萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)抑制黄曲霉的作用研究[D];四川农业大学;2013年
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3 卢雯静;茶树花中茶皂素和茶多酚的综合提取、分离纯化及抑菌性研究[D];安徽农业大学;2012年
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7 涂彩虹;黄曲霉拮抗菌分离鉴定、培养条件优化及其发酵上清液部分特性初步研究[D];四川农业大学;2011年
8 路盼盼;基于PCR-DGGE技术的新疆泥火山土壤真菌多样性分析[D];石河子大学;2011年
9 王星宇;改性壳聚糖金属离子配合物树脂水解蛋白的研究[D];中国海洋大学;2011年
10 吴娜;壳聚糖衍生物—纳米二氧化钛复合材料的制备及表征[D];北京化工大学;2011年
【二级引证文献】
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3 张俊;酵母蛋白酶制剂的研究[D];石河子大学;2016年
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5 古孜亚·吾斯曼;油菜有益根际微生物的分离鉴定与初步应用[D];新疆大学;2015年
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7 迟晨;海洋巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉毒素生物合成及其机制[D];中国海洋大学;2015年
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9 刘晓妮;改性氯甲基壳聚糖金属配合物树脂对磷酯键及肽键水解作用的研究[D];中国海洋大学;2014年
【二级参考文献】
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7 沈建东;蔡秋凤;刘光明;苏文金;曹敏杰;;大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
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中国重要报纸全文数据库 前1条
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中国博士学位论文全文数据库 前3条
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4 赵伟伟;黑豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及活性鉴定[D];山西大学;2016年
5 赵现明;豆类胰蛋白酶抑制剂的提取分离及纯化[D];哈尔滨工业大学;2013年
6 张俏;葵花籽中非竞争型胰蛋白酶抑制剂的发现和纯化[D];吉林大学;2008年
7 梁雪华;大豆胰蛋白酶抑制剂提取及酶法失活技术研究[D];东北农业大学;2011年
8 杜旭东;具有胰蛋白酶抑制剂活性成分的中药筛选及初步鉴定[D];大连工业大学;2008年
9 徐志村;豆浆中胰蛋白酶抑制剂加热失活机理及一种短时豆浆工艺的建立[D];江南大学;2013年
10 李晨;一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性[D];山西大学;2006年
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