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《中国海洋大学》 2010年
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苯并[a]芘对栉孔扇贝分子毒理学机制的研究

苗晶晶  
【摘要】: 本文根据目前我国近海多环芳烃污染现状,选择近海养殖的经济贝类栉孔扇贝(Chlamys farreri)为研究对象,克隆了栉孔扇贝的几种解毒代谢相关基因,包括芳烃受体蛋白(AhR)、混合功能氧化酶中的CYP4、谷胱甘肽硫转移酶中的GSTpi和外源物质抗性蛋白Pgp。研究了苯并[a]芘(BaP)作用下栉孔扇贝组织内BaP累积规律、解毒代谢酶的表达调控规律以及DNA损伤效应,并结合细胞毒性实验研究解毒代谢酶在DNA损伤形成中的作用,探讨BaP对栉孔扇贝的致毒的分子机制。本研究可为近海多环芳烃生物标志物检测技术的建立提供理论依据,为解析多环芳烃对贝类的毒理学机制提供研究基础。 栉孔扇贝芳烃受体蛋白ChfAhR的cDNA全长为2891bp,开放阅读框为2466bp,编码821个氨基酸残基,无信号肽,为胞内蛋白,含有三个核定位序列。BLAST分析表明ChfAhR与其它物种AhR基因具有较高的同源性,预测的蛋白结构与其它已知物种相似。ChfAhR含有螺旋-环-螺旋结构(DNA结合区)和PAS结构域(配体结合区),属于bHLH-PAS转录因子家族。序列分析表明,ChfAhR的bHLH-PAS功能区与无脊椎动物相似性较高,与脊椎动物相似性较低。半定量RT-PCR分析表明ChfAhR在消化盲囊中有较高的表达,其次在成熟♀性腺中,鳃、外套膜和闭壳肌中表达量较少。 栉孔扇贝CYP450基因ChfCYP4的cDNA全长为1927bp,开放阅读框为1317bp,编码438个氨基酸残基,为胞内蛋白,含有内质网膜定位信号位点。BLAST分析表明ChfCYP4与其它物种ChfCYP4基因具有较高的同源性,预测的蛋白结构与其它已知物种相似。ChfCYP4推导的氨基酸序列中存在细胞色素P450家族半胱氨酸血红素铁签名序列(F461SAGPRNCIG470),签名序列中血红素铁结合位点Cys386高度保守。半定量RT-PCR分析表明ChfCYP4在成熟早性腺和外套膜中有较高的表达,其次在鳃、消化盲囊和闭壳肌中也有一定的表达量。 栉孔扇贝GSTpi基因ChfGSTpi的cDNA全长为692bp,开放阅读框为618bp,编码205个氨基酸残基,为胞内蛋白。BLAST分析表明ChfGSTpi与其它物种GSTpi基因具有较高的同源性,预测的蛋白结构与其它已知物种相似。ChfGSTpi氨基酸序列包括位于氮端的谷胱甘肽结合区(GSH binding site, G-site)和碳端的外源物质非特异性结合位点(H-site),配体结合活性位点Tyr109高度保守。半定量RT-PCR分析表明ChfGSTpi在外套膜中表达量最高,在其它组织中也有较高的表达。 栉孔扇贝ChfPgp部分片段cDNA为1345bp,开放阅读框为630bp,编码210个氨基酸残基。BLAST分析表明ChfPgp与其它物种Pgp基因的相应片段同源性较高,预测的蛋白结构与其它已知物种相似。ChfPgp氨基酸序列包括位于氮端的ATP结合区和ABC转运位点L107SGGQKQRVA116等保守区域。半定量RT-PCR分析表明ChfPgp在外套膜中表达量最低,在其它各组织中均有较高的表达。 BaP (0.05、0.2、0.8μg/L)染毒10d清除5d测得的栉孔扇贝消化盲囊中的BaP累积量显著高于软体部中的累积量,湿重表示时,消化盲囊中BaP累积量约为软体部中BaP累积量11.8倍减5.9,干重表示时,消化盲囊中BaP累积量约为软体部中BaP累积量5.7倍加0.2。BaP胁迫对BaP累积量、GSTpi表达水平和DNA加合物含量的影响具有时间剂量效应,GSTpi表达水平、DNA加合物含量和8-OHdG含量与组织中BaP累积呈显著正相关,DNA加合物/8OHdG—BaP累积量回归曲线为指数方程,BaP累积量—GSTpi表达量回归曲线为双曲线单矩三因子方程。ChfAhR和ChfCYP4表达变化未见明显的时间-剂量效应,与组织累积量的相关性亦不显著,但显示了BaP对ChfAhR表达具有一定的诱导作用而对ChfCYP4具有一定的抑制作用,由结果可见GSTpi、DNA加合物和8-OHdG与BaP累积呈一定关系,比较适于作为生物标志物进行进一步的分析和现场验证。 应用BaP和CYP450、GST、Pgp、SOD抑制剂组合对悬浮培育的栉孔扇贝消化盲囊细胞进行染毒实验,结果表明,栉孔扇贝消化盲囊细胞中CYP450在BaP代谢活化中作用不明显,GSTpi对于清除活性中间产物和活性氧具有显著作用。Pgp对于DNA加合物和8OHdG的形成表现为促进作用,SOD在减少8OHdG形成的过程中有重要作用。
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