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《中国海洋大学》 2010年
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皱纹盘鲍抗氧化基因的克隆及其在营养调控下表达的研究

吴成龙  
【摘要】: 皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)隶属于软体动物门,腹足纲(Gastropoda),前腮亚纲(Prosobranchia),原始腹足目(Archaeogastropoda),鲍科(Haliotidae),主要分布在我国渤海和黄海,以及日本和朝鲜的附近海域,是世界重要的名贵海水养殖品种。但是近年来由于环境污染、操作不当、投饲频率增加等原因,使得养殖的皱纹盘鲍不断发生各类病害,其产量大幅度下跌,种质出现衰退现象。而环境中各种胁迫因子的增加和鲍鱼免疫力的下降直接导致病原体的高感染率和鲍鱼的高死亡率。但时至今日,皱纹盘鲍的先天性免疫学研究中仍然存在大量的空白,尤其是如何利用皱纹盘鲍的营养免疫机制来提高其免疫力的研究较少。所以深入开展皱纹盘鲍营养免疫机制研究并在此基础上寻找增加皱纹盘鲍抗胁迫能力的有效方法已成为当务之急。 研究发现,在受到病原体、化学因子、辐射、温度(高温或者低温)变化、溶解氧、营养不良以及其他可能的胁迫条件下,水生生物体会产生大量的活性氧分子。这些活性氧分子能够消灭掉外源入侵者,但同时由于活性氧分子反应的非特异性,它们也会对宿主的细胞、组织和器官造成严重伤害,进而导致皱纹盘鲍生理机能的损伤和免疫系统的破坏。所以,消除皱纹盘鲍体内因过度免疫反应产生的过量氧自由基将能够增强其抵御病原侵染的能力,提高免疫力。为了维持机体健康,避免活性氧对自身细胞造成损伤,阻止由于氧化胁迫引起的疾病和死亡,耗氧生物体在长期的氧胁迫环境以及外界生存环境中形成了一个行之有效的抗氧化体系,以维持体内产生适量ROS和清除多余ROS之间的平衡,进而维持动物机体内氧化和抗氧化之间的动态平衡。其中,包括抗氧化酶系统,如:谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等,以及非酶类抗氧化分子,如硒结合蛋白、铁蛋白、热休克蛋白、维生素C和谷胱甘肽等。 众所周知,生物体内自由基的产生、清除、利用、损伤及其修复所需物质与能量均直接或间接来源于营养物质及其代谢物,即动物体内营养素及其代谢物是各类自由基产生的物质来源;清除自由基系统的成分均直接或间接来自营养素与膳食中抗氧化剂。因此,营养状况应能维持自由基的产生与清除处于正常动态平衡,内环境处于稳定的还原态,并使各类活性氧的生理作用以及彼此相互作用能正常发挥。此外,大量研究已经证明动物体能够通过营养调控的方式获得更好的氧化还原平衡,如通过获得适量的硒、锌、铁和维生素C等。然而,尚未有关于营养素和皱纹盘鲍抗氧化系统在基因转录水平上进行相互作用研究的报道。此外,克隆和鉴定抗氧化反应相关基因将会帮助我们更好的理解对于营养调控的分子生物学机制。 在本研究中,我们首先对皱纹盘鲍氧化还原平衡系统中的硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GPX),硒结合蛋白(SEBP),热休克蛋白90(HSP90)和铁蛋白(FT)等进行了基因全长克隆,并对其分子结构特征、组织分布特征及其在营养(硒、铁和锌)调控下的表达特征进行了相关分析。此外,我们还应用荧光定量PCR技术,对经过维生素C调控下的皱纹盘鲍抗氧化相关基因(Cu/Zn-SOD,Mn-SOD,CAT,GPX,GST, Tpx, SEBP, HSP26, HSP70和HSP90)和氧化胁迫相关基因(NF-κB)进行了相对定量的表达分析。 1皱纹盘鲍谷胱甘肽过氧化物酶的基因克隆及其在饲料中不同浓度硒、锌和铁元素处理下的表达分析 以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)(平均体长:65.01±0.45 mm)为材料,利用同源克隆技术和RACE技术从皱纹盘鲍肝脏中成功扩增出中硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase, HdhGPx)。HdhGPx全长为963bp(Genbank中的注册号为GU254066),包括21bp的5'非编码区、273 bp的3'非编码区和669 bp的开放阅读框。另外,在3'非编码区还存在一个101bp的SECIS作用原件。其中HdhGPx的开放阅读框编码222个氨基酸,预测分子量约为24.76 KDa,理论等电点为7.00;在其N端含有一个23个氨基酸残基编码的信号肽。在HdhGPx的cDNA序列中含有一个典型的终止密码子(235TGA237)用于编译硒半胱氨酸(U72),一个GPx信号基序2(96LGLPCNQF103),一个GPx活化位点基序(179WNFEKF184)。此外,在HdhGPx的氨基酸序列中还存在两个潜在的蛋白质糖基化位点(112NGTE115和132NLTQ135)。在三维空间结构上,HdhGPx显示出与人GPx3具有更高的结构相似性。实时荧光定量PCR检测结果显示,HdhGPx mRNA在肝脏、外套膜、鳃、性腺、肌肉和肾脏中的表达量要显著高于在血细胞中的表达量,而且在肝脏中的表达量为最高。通过分别用不同浓度的微量元素硒(0.15mg/kg,1.32mg/kg和48.7 mg/kg)、锌(6.69mg/kg,33.85 mg/kg和710.63 mg/kg)和铁(29.19 mg/kg,65.7 mg/kg和1267.2 mg/kg)的饲料来饲喂幼鲍(平均体长:13.05±0.25 mm)20周后,分别取其肝脏和血细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR技术进行HdhGPx mRNA的表达分析。分析结果显示,在硒处理组,皱纹盘鲍肝胰脏中HdhGPx mRNA的表达量随硒添加量增加而升高。皱纹盘鲍肝胰脏中HdhGPx mRNA的表达量在硒添加量为1.32 mg/kg时表达量最高,但皱纹盘鲍血细胞中HdhGPx mRNA的表达量在硒过量组(48.7 mg/kg)为最高。在锌处理组,皱纹盘鲍肝胰脏中HdhGPx mRNA的表达量升高,但是在锌添加量为33.85mg/kg达到最高。在铁处理组,皱纹盘鲍HdhGPx mRNA的表达量呈现先升高后降低的趋势,即在铁适量组(65.7 mg/kg)为最高,而后在铁过量组(1267.2 mg/kg)肝胰脏中HdhGPx的表达量降低。上述研究结果表明HdhGPx的表达受到饲料中微量元素(硒、锌和铁)添加量的影响,而且可能在提高机体抗氧化能力和防止由微量元素含量过高引起的氧化胁迫中担负重要作用。 2皱纹盘鲍硒结合蛋白的基因克隆及其在饲料中不同浓度硒、锌和铁元素处理下的表达分析 利用同源克隆技术和RACE技术从皱纹盘鲍肝脏中成功扩增出中硒结合蛋白(selenium-binding protein, HdhSEBP)。HdhSEBP全长为2071bp(Genbank中的注册号为GU014544),包括55bp的5'非编码区、522 bp的3'非编码区和1494 bp的开放阅读框。其中HdhSEBP的开放阅读框编码497个氨基酸,预测分子量约为55.6 KDa,理论等电点为5.47。BLAST分析结果显示HdhSEBP与其他物种,如哺乳动物、鸟、鱼和无脊椎动物的SEBP氨基酸序列具有高度的相似性。此外,HdhSEBP的氨基酸序列中还存在多个金属结合位点和一个潜在的蛋白质糖基化位点(320NKTV323)。实时荧光定量PCR检测结果显示,HdhSEBP mRNA在外套膜、肾脏、肝脏和血细胞中的表达量要显著高于在鳃、性腺和肌肉中的中的表达量,而且以在外套膜中的表达量为最高。通过分别用不同浓度的微量元素硒(0.15 mg/kg,1.32 mg/kg和48.7 mg/kg)、锌(6.69 mg/kg,33.85 mg/kg和710.63 mg/kg)和铁(29.19 mg/kg,65.7 mg/kg和1267.2mg/kg)的饲料来饲喂幼鲍(最初体长:13.05±0.25 mm)20周后,分别取其肝脏和血细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR技术进行HdhSEBP mRNA的表达分析。分析结果显示,在硒处理组,皱纹盘鲍肝胰脏中HdhSEBP mRNA的表达量随硒添加量增加而升高。皱纹盘鲍肝胰脏和血细胞中HdhSEBP mRNA在硒添加量为1.32 mg/kg时表达量均为最高水平。在锌处理组,皱纹盘鲍肝胰脏和血细胞中HdhSEBP mRNA在锌添加量为33.85 mg/kg时表达量均为最高,但是在锌添加量为710.63 mg/kg降低到最低水平。在铁处理组,皱纹盘鲍HdhSEBP mRNA的表达量呈现先升高后降低的趋势,即在铁适量组(65.7 mg/kg)为最高,而后在铁过量组(1267.2 mg/kg)中HdhSEBP的表达量降低。上述研究结果表明HdhSEBP的表达受到饲料中微量元素(硒、锌和铁)添加量的影响,而且可能在提高机体抗氧化能力和防止由微量元素含量过高引起的氧化胁迫中担负重要作用。 3.皱纹盘鲍热休克蛋白90的基因克隆及其在饲料中不同浓度硒、铁和锌元素处理下的表达分析 以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)(平均体长:65.01±0.45 mm)为材料,利用同源克隆技术和RACE技术从皱纹盘鲍肝脏中成功扩增出中热休克蛋白90(heat shock protein 90, HdhHSP90)。HdhHSP90全长为2660 bp (Genbank中的注册号为GU014545),包括96 bp的5’非编码区、377 bp的3’非编码区和2187 bp的开放阅读框。其中HdhHSP90的开放阅读框编码728个氨基酸,预测分子量约为84.134 KDa,理论等电点为4.619。BLAST分析结果显示HdhHSP90与其他物种,如哺乳动物、鸟、鱼和无脊椎动物的HSP90氨基酸序列具有高度的同源性。在HdhHSP90氨基酸序列中含有6个典型的热休克蛋白家族的信号基序(NKEIFLRELISNSSDALDKIR, LGTIAKSGT, IGQFGVGFYSAYLVAE, IKLYVRRVFI, GVVDSEDLPLNISRE, MEEVD)。实时荧光定量PCR检测结果显示,HdhHSP90 mRNA在性腺和血细胞中的表达量较高。通过分别用不同浓度的微量元素硒(0.15 mg/kg,1.32 mg/kg和48.7mg/kg)、锌(6.69 mg/kg,33.85 mg/kg和710.63 mg/kg)和铁(29.19 mg/kg,65.7 mg/kg和1267.2 mg/kg)的饲料来饲喂幼鲍(最初体长:13.05±0.25mm)20周后,分别取其肝脏和血细胞总RNA。荧光定量PCR分析结果显示,在硒处理组,皱纹盘鲍肝胰脏中HdhHSP90 mRNA的表达量随硒添加量增加而升高。皱纹盘鲍肝胰脏和血细胞中HdhHSP90 mRNA在硒添加量为1.32 mg/kg时表达量均为最高水平。在锌处理组,皱纹盘鲍肝胰脏和血细胞中HdhHSP90 mRNA在锌添加量为33.85 mg/kg时表达量均为最高,但是在锌添加量为710.63 mg/kg降低到最低水平。在铁处理组,皱纹盘鲍HdhHSP90 mRNA的表达量呈现先升高后降低的趋势,即在铁适量组(65.7 mg/kg)为最高,而后在铁过量组(1267.2 mg/kg)中HdhHSP90的表达量降低。上述研究结果表明HdhHSP90的表达受到饲料中微量元素(硒、锌和铁)添加量的影响,而且可能在提高机体抗胁迫能力和保护动物机体免受由饲料中微量元素(硒、锌和铁)含量过高引起的氧化胁迫中担负重要作用。 4皱纹盘鲍铁蛋白的基因克隆及其在饲料中不同浓度铁元素处理下的表达分析 利用文库构建技术和RACE技术从皱纹盘鲍肝脏中成功扩增出中一个新型的铁蛋白(ferritin, HdhNFT)。HdhNFT全长为915bp(Genbank中的注册号为GU479917),包括103 bp的5'非编码区、296 bp的3'非编码区和516 bp的开放阅读框。其中HdhNFT的开放阅读框编码171个氨基酸,预测分子量约为19.8 KDa,理论等电点为4.79。BLAST分析结果显示HdhNFT与其他物种,如哺乳动物、鸟、鱼和无脊椎动物的FT氨基酸序列具有高度的相似性。此外,HdhNFT的氨基酸序列中还存在一个潜在的蛋白质糖基化位点(27NCSY30)。实时荧光定量PCR检测结果显示,HdhNFT mRNA在肾脏、肝脏、鳃、肌肉和外套膜和血细胞中的表达量要显著高于在性腺和血细胞中的中的表达量,而且以在肾脏中的表达量为最高。通过用不同浓度的微量元素铁(29.19 mg/kg,65.7 mg/kg,1267.2 mg/kg和6264.7 mg/kg)的饲料来饲喂幼鲍(最初体长:13.05±0.25mm)20周后,分别取其肝脏和血细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR技术进行HdhSEBP mRNA的表达分析。分析结果显示,皱纹盘鲍HdhNFT mRNA的表达量呈现升高的趋势,即随铁添加量的增加,在铁过量组(6264.7mg/kg)中HdhNFT的表达量最高。上述研究结果表明HdhNFT的表达受到饲料中铁元素添加量的影响,而且可能在提高机体抗氧化能力和防止由铁元素含量过高引起的氧化胁迫中担负重要作用。 5饲料中添加维生素C对皱纹盘鲍肝胰腺中抗氧化和胁迫相关基因表达的影响 本研究以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)(平均体长:84.36±0.24 mm)为研究对象,探讨饲料中添加不同梯度维生素C对皱纹盘鲍肝胰腺组织中抗氧化胁迫相关基因(超氧化物歧化酶,SOD;过氧化氢酶,CAT;谷胱甘肽过氧化物酶,GPX;谷胱甘肽-S-转移酶,GST;硒结合蛋白,SEBP;热休克蛋白26,HSP26;热休克蛋白70,HSP70;热休克蛋白90,HSP90)以及细胞核转录因子Rel/NF-κB等在转录水平上表达的影响。通过用添加了不同浓度维生素C(0.0 mg/kg,70.3 mg/kg,829.8 mg/kg和4967.5 mg/kg)的饲料来饲喂皱纹盘鲍成鲍,在室内流水系统养殖24周后,取其肝脏总RNA,利用实时荧光定量PCR技术进行相关基因的表达水平的分析。分析结果显示,与基础饲料组相比,饲料中添加适量的维生素C (70.3 mg/kg)能够显著提高皱纹盘鲍肝胰腺中抗氧化相关基因(Cu/Zn-SOD,CAT,GST,NFT,HSP26)mRNA的表达量,但是显著降低Mn-SOD,GPX,TPx和SEBP mRNA的表达量。与添加适量的维生素C (70.3 mg/kg)饲料组相比,添加过量的维生素C(829.8 mg/kg和4967.5mg/kg)显著提高皱纹盘鲍肝胰腺中Mn-SOD,GPX,TPx,SEBP,NFT,HSP70,HSP90和NF-κB mRNA的表达量。上述研究结果表明饲料中维生素C能够影响皱纹盘鲍抗氧化胁迫相关基因的表达量,这提示饲料中添加适量的维生素C能够提高机体抗氧化能力,减轻机体内的氧化胁迫程度。但是饲料中添加过量的维生素C会起到氧化剂的作用,从而降低皱纹盘鲍机体的抗胁迫能力。 总体而之,饲料中添加适量的微量元素(硒、锌和铁)或抗氧化剂(维生素C)能够显著提高皱纹盘鲍抗氧化相关基因的表达量,进而提高机体的抗氧化胁迫的能力。而过量的微量元素(硒、锌和铁)或维生素C会起到氧化剂的效果,会对皱纹盘鲍抗氧化功能造成负面的影响,从而降低抗胁迫能力。
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