收藏本站
《中国海洋大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

文昌鱼(Branchiostoma japonicum)Plgl和IGF基因的表达和功能

刘明英  
【摘要】: 文昌鱼(amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是现存的与脊椎动物祖先最接近的无脊椎动物,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的重要模式动物。文昌鱼基因的序列和表达模式已经被广泛用于不同物种之间的比较基因组学研究和发育同源性分析。本文从文昌鱼(Branchiostoma japonicum)中克隆了在与脊椎动物肝脏特异性表达的纤溶酶原(Plg)基因,并对其结构、进化、表达和功能进行了研究,同时深入研究了也在脊椎动物肝脏特异性表达的胰岛素样生长因子(IGF)的功能,为脊椎动物肝脏的起源提供了更多证据。 我们在文昌鱼中克隆了一个全长1949 bp的Plg cDNA,其开放阅读框长度为1290 bp,5’非翻译区长123 bp,3’非翻译区长536 bp,该cDNA包含的最长开放阅读框编码一个430个氨基酸的蛋白,分子量大约为48 kDa,将其命名为BbPlgl。运用信号肽分析预测软件Signal IP 3.0 server进行信号肽预测揭示其氨基端16个氨基酸为信号肽。通过经NetNGlyc 1.0 Server糖基化预测,在32位氨基酸处存在一个潜在的糖基化位点,因此推测BbPlgl可能为一种糖蛋白。BLASTp搜索结果显示该蛋白的氨基端含有两个kringle结构域,羧基端为类丝氨酸蛋白酶结构域。两个kringle结构域K1和K2在氨基酸水平上存在51.9%的一致性,而且BbPlgl的K1和K2与已知纤溶酶原的K1分别存在43.0%-58.2%和41.8%-51.9%的一致性,与K2分别存在41.8%-51.9%和50.6%-60.9%的一致性,与K3分别存在49.4%-57.0%和51.9%-63.3%的一致性,与K4分别存在50.6%-55.7%和46.8%-55.7%的一致性,与K5分别存在50.6%-57.0%和44.3%-50.6%的一致性,说明BbPlgl的K1和K2可能是纤溶酶原K1-K5的原型。将BbPlgl的kringle结构域和类丝氨酸蛋白酶结构域分别与纤溶酶原-凝血酶原家族成员的相应结构域构建系统进化树,结果显示文昌鱼BbPlgl的K1与kringle结构域的groupⅠ聚簇,BbPlgl的K2与kringle结构域的groupⅡ聚簇,类丝氨酸蛋白酶结构域位于纤溶酶原-载脂蛋白A亚家族(包括Plg, HGF, MSP, APOA)的基部,这些结果显示BbPlgl或许代表纤溶酶原-载脂蛋白A亚家族的一种原型。构建BbPlgl的原核表达载体,转化大肠杆菌后诱导表达。Western blotting结果显示该蛋白为重组表达蛋白。纯化的重组蛋白能够被人尿激酶所激活并对纤溶酶原的特异性发色底物S2251表现出8.7 mU/mg的酶活力。Northern blotting的结果显示BbPlgl的转录产物为单一条带,长度约为2000 bp。原位杂交显示BbPlgl转录本在肝盲囊和后肠中的表达量最高,在内柱、内柱下面的血管、鳃、卵巢有低水平的表达,而在肌肉、神经管和脊索和精巢中没有杂交信号。所有这些都表明,文昌鱼Plgl可能代表纤溶酶原-载脂蛋白A亚家族的一种原型,并且其表达具有组织特异性;同时,这也显示在Plg合成方面,文昌鱼的肝盲囊和脊椎动物的肝脏具有相似性,支持了文昌鱼肝盲囊和脊椎动物肝脏在功能上的相似性。 为了更深入的探讨BbIGF功能和作用机制,进一步为研究原索动物的GH/IGF轴提供证据,本研究中将BbIGF基因中与脊椎动物IGF成熟肽对应的区域进行体外重组表达,构建BbIGF-MP的表达载体,转化大肠杆菌后诱导表达,纯化重组蛋白并进行质谱鉴定。我们采用组织消化法成功分离培养了昆明小鼠的原代肌肉细胞,并借助RT-PCR对其进行了初步鉴定。以体外分离培养的小鼠原代肌肉细胞为模型,以脊椎动物(人)的重组IGF-I做为参照,主要为了解决以下问题:(1)鉴定文昌鱼BbIGF-MP是否像人IGF-I一样具有和肌肉细胞以及肌肉组织IGF-I受体粗提物的结合能力;(2)鉴定BbIGF-MP是否能像人IGF-I一样做为促分裂原,促进肌肉细胞的增殖;(3)鉴定BbIGF-MP和人IGF-I在肌肉细胞中是否激活相同的胞内信号传导通路来发挥作用。结合实验显示异硫氰酸荧光素(FITC)标记的重组蛋白BbIGF-MP能够像脊椎动物IGF-I一样和原代肌肉细胞结合,同时酶联免疫吸附实验确定了其能够与小鼠肌肉组织以及文昌鱼中的IGF受体粗提物结合。MTT分析显示在10μg/ml的时候文昌鱼BbIGF-MP即能够显著促进细胞增殖,并呈现浓度依赖性,说明其具有促有丝分裂的功能。Western blot结果显示文昌鱼BbIGF-MP与不同时期原代肌肉细胞孵育后,能像重组人IGF-I一样在不同程度上促进MAPK和Akt的磷酸化,说明其通过这两条信号通路发挥作用。以上的研究进一步证实了文昌鱼BbIGF是功能上更接近IGF的insulin/IGF杂合多肽,而且其能够以和脊椎动物IGF-I相似的机制发挥功能。在脊椎动物中,IGFs尽管可以在多种组织中表达但其主要的合成部位仍是肝脏。肝脏是多种激素的重要的靶器官,而文昌鱼的肝盲囊一直被认为是脊椎动物肝脏的前体。我们的研究结果显示文昌色BbIGF与IGFs功能及作用机制的一致性,同时BbIGF在文昌鱼肝盲囊和后肠表达最为丰富,这进一步支持了文昌鱼肝盲囊是脊椎动物肝脏同源器官的推论,将GH/IGF轴进化的源头向前推进到了原始的脊索动物,也为进一步研究原索动物的GH/IGF轴铺平了道路。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S917.4

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 王磊;宿红艳;冯培勇;张士璀;;文昌鱼与比较基因组学和分子发育生物学[J];海洋湖沼通报;2005年04期
2 方永强;文昌鱼在生殖内分泌进化中的地位[J];科学通报;1998年03期
3 张殿昌;鱼类胰岛素样生长因子研究进展[J];上海水产大学学报;2005年01期
4 方永强,王龙;文昌鱼轮器哈氏窝匀浆对幼体蟾蜍睾丸发育的初步探讨[J];实验生物学报;1984年01期
5 方永强,周寿康,翁幼竹,赵瑞钦;LH_βmRNA在文昌鱼脑和哈氏窝的定位及其表达[J];自然科学进展;2001年09期
6 方永强,翁幼竹,胡晓霞;文昌鱼内柱结构与功能及其神经内分泌调节[J];自然科学进展;2002年10期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张致一;生殖内分泌的演化[J];动物学报;1982年03期
2 方永强;丘脑下部促黄体素释放激素类似物(LHRH-A)对文昌鱼精子发生的影响:组织学及其超微结构的研究[J];动物学报;1985年04期
3 方永强,林秋明;哺乳动物促性腺激素对文昌鱼卵母细胞成熟的影响[J];动物学报;1993年04期
4 翁幼竹,方永强,胡晓霞;雌、雄激素受体在文昌鱼神经系统和哈氏窝的免疫识别[J];动物学报;2001年06期
5 方永强,翁幼竹,黄威权,孙岚;芳香化酶在文昌鱼神经系统、哈氏窝和性腺特异性定位:原位杂交和免疫细胞化学研究(英文)[J];动物学报;2003年06期
6 庞秋香,张士璀,王长法,王昌留,张永忠;雌雄文昌鱼同工酶的表型差异[J];动物学报;2004年01期
7 曹玉萍,闫路娜,谢松,刘震;昌黎海区文昌鱼初步调查[J];动物学杂志;2001年03期
8 刘娟,陈玥,郭丽然,谷波,刘慧,侯安燕,刘学峰,刘定震;圈养大熊猫刻板行为观察及其激素水平测定[J];北京师范大学学报(自然科学版);2005年01期
9 刘凤莲,付立波;评新版《人体及动物生理学》教材[J];长春师范学院学报;2003年05期
10 王义权;方少华;;文昌鱼分类学研究及展望[J];动物学研究;2005年06期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 陈细法;陈平;黄一玲;薛茹;洪水根;林加涵;;轮器中神经血管分布的超微结构观察[A];第六次全国电子显微学会议论文摘要集[C];1990年
2 方永强;;文昌鱼哈氏窝结构功能的神经内分泌调节研究进展[A];中国动物科学研究——中国动物学会第十四届会员代表大会及中国动物学会65周年年会论文集[C];1999年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘振辉;文昌鱼分子生物学:AmphiHMGB、AmphiUbf80和AmphiPrxV基因克隆、表达与进化研究[D];中国海洋大学;2003年
2 王昌留;青岛文昌鱼染色体的核型及带型研究[D];中国海洋大学;2003年
3 汪涛;高分化胰腺癌多药耐药机制及靶向逆转的初步研究[D];第三军医大学;2003年
4 汤绍辉;人肝癌胰岛素样生长因子Ⅱ基因启动子结构与功能研究[D];暨南大学;2004年
5 刘梅;文昌鱼分子生物学:AmphiSRP19、AmphiLysC与AmphiS19基因克隆、表达和进化研究[D];中国海洋大学;2004年
6 徐剑锋;PTP1B为靶位利用RNAi技术治疗糖尿病的初步研究[D];复旦大学;2005年
7 林浴霜;青岛文昌鱼早期发育相关基因AmphiMdp和brp-like的研究[D];山东大学;2005年
8 胡家会;文昌鱼和玫瑰无须鲃的精子运动及其在污染物急性毒性检测中的应用[D];中国海洋大学;2005年
9 王勇军;文昌鱼cathepsin、β-MSP和allantoicase基因的特征、表达和进化研究[D];中国海洋大学;2005年
10 石毅;生长激素对胰腺癌细胞生长周期的影响及生长激素受体-JAK2-STATs在信号转导中的意义[D];中国协和医科大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 闫路娜;秦皇岛海区文昌鱼分类地位的研究[D];河北大学;2000年
2 李萍;昆虫呼吸系统中“肺”的研究[D];西北农林科技大学;2001年
3 胡晓霞;文昌鱼内柱和锱鱼甲状腺结构与功能神经内分泌调控的比较研究[D];国家海洋局第三海洋研究所;2001年
4 刘国霞;长效促红细胞生成素(LL-EPO)的放射性标记、分离纯化和鉴定[D];四川农业大学;2002年
5 朱骞;GH/IGF-I受体与雌激素受体在蛋鸡子宫中的表达[D];南京农业大学;2003年
6 李泓彦;神经递质和性类固醇激素及其受体在皱瘤海鞘神经复合体和性腺中的定位研究[D];国家海洋局第三海洋研究所;2003年
7 蒋广龙;成年小鼠半去势睾酮代偿性分泌初探[D];首都师范大学;2004年
8 杜艳;芯片毛细管电泳电化学检测的研究与应用[D];吉林大学;2004年
9 韩晓英;人工感染鸭瘟病毒急性病理模型的病理学发展规律及免疫荧光检测石蜡切片中鸭瘟病毒分布规律的研究[D];四川农业大学;2004年
10 王英红;电刺激疑核对大鼠胃运动和胃粘液分泌的影响及其作用机理的研究[D];山东师范大学;2004年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张致一;生殖内分泌的演化[J];动物学报;1982年03期
2 方永强;丘脑下部促黄体素释放激素类似物(LHRH-A)对文昌鱼精子发生的影响:组织学及其超微结构的研究[J];动物学报;1985年04期
3 方永强;文昌鱼Sertoli细胞超微结构的进一步研究[J];动物学报;1991年02期
4 方永强,黄威权,齐襄,苏慧慈;血管活性肠肽(VIP)在文昌鱼体内免疫组织化学定位的研究[J];动物学报;1991年04期
5 方永强,林秋明;哺乳动物促性腺激素对文昌鱼卵母细胞成熟的影响[J];动物学报;1993年04期
6 殷红,张崇理,王红,沈卫斌;排卵、排精前后文昌鱼体内GnRH的研究[J];动物学报;1994年01期
7 方永强,黄威权,陈蕾,张金山;GnRH在文昌鱼脑和哈氏窝的分布[J];动物学报;1999年01期
8 华益民,林浩然;营养状况对幼年鲤鱼肝脏IGF-ⅠmRNA表达的影响[J];动物学报;2001年01期
9 华益民,林浩然;草鱼IGF-ⅠcDNA的克隆和在原核生物中的表达[J];动物学报;2001年03期
10 林加涵,陈细法,汪德耀;文昌鱼精子发生过程中的超微结构研究[J];海洋与湖沼;1987年05期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 邵宗泽,喻子牛;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白作用的分子机制研究进展[J];生物工程进展;2001年06期
2 ;GS3蛋白不同结构域的功能与水稻谷粒大小的关系[J];科学通报;2011年07期
3 翟峰;张勇;;钙蛋白酶抑制蛋白与肉嫩度相关性[J];中国饲料;2007年16期
4 赵丽坤;苏维;;植物抗病基因的几个结构域[J];科技信息(科学教研);2008年15期
5 张荣;陈欧;王振英;;RGA法标记植物抗病基因的研究进展[J];天津农业科学;2009年01期
6 吴洪福;郭淑元;李海涛;高继国;;苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展[J];东北农业大学学报;2009年02期
7 高彦;张勇;陈昆;郑兰宇;;钙蛋白酶系统与猪肉嫩度的相关性研究[J];养殖与饲料;2009年07期
8 陈旭东;唐茂妍;计成;田建华;;蛋白酶体及其与肉品质的关系[J];中国饲料;2006年16期
9 汪世华;王文勇;黄益洲;林琳;沙莉;;丝氨酸蛋白酶研究进展[J];福建农业学报;2007年04期
10 王丽丽;朱祯;李霞;;精氨酸甲基转移酶及其生物学功能研究进展[J];中国农学通报;2008年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 宋婀莉;田瑞;马素参;高友鹤;;PDZ结构域低丰度配体的筛选方法[A];中国蛋白质组学第三届学术大会论文摘要[C];2005年
2 单璐;童宇峰;冯银钢;王金凤;;金黄色葡萄球菌核酸酶无脯氨酸突变体的溶液结构及骨架动态特性研究[A];第十三届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2004年
3 于长清;沈楠;周建华;;宿主天然抗逆转录病毒蛋白TRIM5α研究进展[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
4 赵明炜;王恩多;;亮氨酰-tRNA合成酶CP1结构域对于种属间tRNA~(Leu)的识别至关重要[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
5 傅成波;杜延顺;黄秉仁;谢云飞;苑玉和;白氡;崔迎彬;;TRAF6与RanBPM相互作用的研究[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
6 于冰;缪泽鸿;蒋轶;李美红;杨娜;李婷;丁健;;c-Jun的非转录功能:与ODD结构域结合地阻断缺氧诱导因子HIF-1泛素化降解[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
7 刘慧萍;柴玉波;陈苏民;王志珍;;蛋白质二硫键异构酶结构域的克隆与活性研究[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
8 李刚;邰付菊;骆娟;郑勇;李学宝;;两个新的棉花基因在NaCl胁迫下的表达调控分析[A];基因开启未来:新时代的遗传学与科技进步——湖北省遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2009年
9 贾卫;金伯泉;张新海;杨琨;朱勇;刘雪松;李琦;;CD226(PTA1)分子D1结构域参与NK和CTL的功能[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
10 李祥;张家海;曹赞霞;吴季辉;施蕴渝;;GOPC蛋白PDZ结构域的溶液结构及其与Neuroligin羧基末端的相互作用[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 医学院;颜宁研究组在《自然》发文[N];新清华;2011年
2 吴一福;四军医大首次发现人脑抑癌新基因[N];中国医药报;2005年
3 记者 彭德倩;我科学家发现谷类“大个子”基因[N];解放日报;2006年
4 白毅;我国重大疾病相关基因及蛋白功能转化研究获进展[N];中国医药报;2008年
5 北京德宝群兴科贸有限公司 刘晓凯;营养因素对动物体脂肪沉积的影响及调控机理[N];中国畜牧报;2004年
6 记者 项铮;单抗可能成为靶向性强的肿瘤药物[N];科技日报;2005年
7 胡建和 陈永耀 王自良 谢庆阁;新型猪瘟疫苗的研究和应用前景[N];中国畜牧报;2005年
8 本版编辑;血友病:“玻璃人”疾病[N];中国医药报;2006年
9 庄新茂;新型猪瘟疫苗的研究和应用前景[N];中国畜牧报;2005年
10 ;海南医学院及附属医院硕果累累[N];科技日报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴益民;三个含SCAN结构域的锌指蛋白基因ZNF191、ZNF396和ZNF397研究[D];复旦大学;2002年
2 何华伟;肌酸激酶结构域相互作用与活性中心极性微环境的研究[D];清华大学;2007年
3 刘奕彤;Ccd1激活Wnt信号通路的分子机制[D];清华大学;2010年
4 姚锋;文昌鱼肽聚糖识别蛋白基因的表达及功能[D];中国海洋大学;2012年
5 刘明英;文昌鱼(Branchiostoma japonicum)Plgl和IGF基因的表达和功能[D];中国海洋大学;2010年
6 毛大庆;野油菜黄单胞菌感光相关基因功能研究[D];清华大学;2011年
7 吴勃;人源蛋白Vav2和Arap3的结构与功能研究[D];中国科学技术大学;2010年
8 陈文钦;草鱼核苷酸结合寡聚化结构域基因和γ-干扰素相关基因的克隆及其表达[D];华中农业大学;2010年
9 阮建彬;组蛋白甲基化位点结合结构域的结构与功能研究[D];中国科学技术大学;2012年
10 张明香;STAT4、STAT6与CBP相互作用及其关键结构域的检测[D];重庆医科大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 夏思思;海洋放线菌氨基酸腺苷化结构域的克隆、表达和酶活性测定[D];华中师范大学;2012年
2 梁琳;颗粒裂解肽抗菌结构域的重组表达和生物活性分析[D];安徽大学;2011年
3 唐自钟;内切葡聚糖酶基因同源和异源结构域重构研究[D];四川农业大学;2011年
4 李丽;Connexin 31与p62相互作用的研究[D];中南大学;2012年
5 冯帆;新基因CCP22功能的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
6 王慧敏;重组人pro-EMAPⅡ蛋白N末端结构域作用机制初步研究[D];安徽大学;2010年
7 薄联锋;CARD结构域对猪BCL 10表达及细胞周期的影响[D];西北农林科技大学;2011年
8 白露;真核原核表达UHRF2各结构域突变体蛋白[D];重庆医科大学;2012年
9 徐军;侧链氢键对嗜热酯酶APE1547及其推进器结构域稳定性的影响[D];吉林大学;2011年
10 陈华;动脉粥样硬化血栓形成关键蛋白vWF A2结构域的结构与调控机制的研究[D];复旦大学;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026