哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆免疫保护作用

【摘要】：哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性的海洋细菌,广泛分布于海洋环境及海洋生物,能引起海水鱼类及其它养殖动物发病,是世界上许多国家和地区养殖对虾和鱼类的致病菌,也是我国海产经济鱼类弧菌病的主要病原菌之一,给海水养殖业造成了巨大的经济损失。哈维氏弧菌的胞外蛋白酶、磷酯酶、溶血素、Ⅲ型分泌系统、密度感应系统等与其致病性密切相关。目前国内对细菌病防治仍然主要靠化学药物及抗生素,由此带来的环境污染、药物残留及细菌耐药性现象日益明显。疫苗防治方法由于安全无污染,是未来疾病防治的首选措施。 微生物常遇到环境中较多的活性氧自由基的损害。硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和NADPH,是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统,广泛地存在于真核生物和原核生物中。硫氧还蛋白系统与体内细胞氧化还原反应、核酸代谢、细胞生长密切相关。其中,硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶。主要功能是催化NADPH将小分子蛋白硫氧还蛋白上的二硫键(-S-S)还原成(-SH)2的反应,维持Trx的还原型,可以维持细胞自由基产生和清除之间的平衡,在微生物适应环境及细菌致病性方面发挥重要作用。 本文从致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶基因的1133 bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple,测序结果表明,目的片段含有960 bp的硫氧还蛋白还原酶基因阅读框,编码319个氨基酸残基的蛋白质。BLAST分析显示氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列相似性为分别为99%、98%、96%、94%、92%,该基因被命名为trxR。构建表达质粒pET-28a(+)/trxR后转化至大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子量为34 kDa。用Ni琼脂糖亲和柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆,直接ELISA法检测了1-4周特异性抗体的效价。结果表明,1-4周内特异性抗体效价持续升高,达到log27.0。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1进行人工感染,对照组的死亡率为100%,免疫组的死亡率为25%,免疫保护率为75%。表明哈维氏弧菌TrxR蛋白具有良好的免疫原性,可作为亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。