海洋半乳寡糖芯片制备及寡糖与凝集素相互作用研究

【摘要】：本论文以红藻来源的半乳聚糖,κ-,τ-,λ-卡拉胶、琼胶、硫琼胶以及化学处理得到的脱硫κ-,λ-卡拉胶为原料,采用弱酸降解制备各种寡糖混合物,通过低压凝胶渗透色谱(Low pressure gel permeation chromatography, LPGPC)技术获得各系列寡糖单体37个,其中9个为首次获得。通过电喷雾离子化质谱(Electrospray ionization mass chromatography, ESI-MS)方法对所得寡糖结构和序列进行了确证。以制备的半乳寡糖为原料,通过还原胺化法将其与具有氨基的磷脂(DHPE)偶联,制备了40个拟半乳寡糖脂,其中14个为首次获得。 以制备的拟糖脂为原料,考察了四种构建糖芯片的方法,即薄层点样仪制备微型糖芯片、手动点样仪制备微型糖芯片、薄层点样仪制备min-糖芯片和全自动芯片点样仪制备高密度糖芯片的优缺点。结果表明,mini-糖芯片适合于海洋糖芯片的构建,而微型芯片适用于糖与蛋白结合实验的条件摸索。利用mini-糖芯片技术和ELISA实验方法对各半乳寡糖与RCA_(120)结合,首次研究发现RCA_(120)特异性识别非还原端为Galβ1,4anGal结构的寡糖,进一步研究还发现:(1)非还原端Gal的C-2或C-6位被硫酸基取代后,可增强其与RCA_(120)的亲和力;(2)非还原端Gal的C-4位被硫酸基取代后,会失去与RCA_(120)的亲和力,除去C-4位硫酸基后亲和力将显著升高;(3)非还原端Gal的C-3位被α-Gal取代后,对RCA_(120)亲和力无影响,但被α-L-anGal取代后,将完全失去与RCA_(120)结合能力。各半乳寡糖与RCA_(120)的亲和力顺序为:Gal6Sβ1,4anGal(L)-R Gal2Sβ1,4Gal2S6S-R Galβ1,4anGal(L)-R Galβ1,4GlcNAc-R Galβ1,4anGal(D)-R Galβ1,4Gal-R≈Galα1,3Galβ1,4Gal-R Gal4Sβ1,4anGal(D)-R≈Galβ1,3GlcNAc-R≈Neu5Acα2,6Galβ1,4GlcNAc-R≈anGal(L)α1,3Gal6Sβ1,4anGal(L)-R (R代表单糖或寡糖)。ECL特异性识别含有乳糖胺(Galβ1,4GlcNAc-R)结构单元,非还原端Gal羟基被任何其它基团取代后,都影响其亲和力,但非还原端为Galβ1,4anGal(L or D)结构的寡糖与ECL有微弱的结合力。 此外,利用构建的mini-糖芯片技术还研究了30种半乳寡糖与Galectin-3的亲和力差异。结果表明:Galectin-3除了识别常规Galβ1,4GlcNAc结构外,与琼胶七糖以上寡糖(Galβ1,4anGal(L)-R)以及三至五糖的硫琼胶寡糖(Gal6Sβ1,4anGal(L)-R)有较强的亲和力。该结果为硫琼胶寡糖作为Galectin-3抑制剂,用于新型抗肿瘤药物的开发提供了基础。