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《中国海洋大学》 2012年
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蛋白质O-GlcNAc修饰研究的方法探讨

丛琦  
【摘要】:氧连接的氮乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰是普遍存在于哺乳动物中的蛋白质翻译后修饰。自1984年发现这种修饰以来,大量的研究证明O-GlcNAc修饰对蛋白质的折叠、转运、活性、稳定性等有重要影响,对蛋白质的功能具有不可替代的调节作用。至今已经发现超过1000多种蛋白质具有O-GlcNAc修饰,这些蛋白质参与几乎所有的生理过程。O-GlcNA修饰的异常与癌症、糖尿病和心血管疾病等密切相关。直接调节O-GlcNAc修饰的酶只有两种,即将UDP-GlcNAc上的GlcNAc修饰到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸上的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和将O-GlcNAc从蛋白质上去除的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)。 O-GlcNAc修饰在生理和病理过程中发挥极其重要的作用,因此O-GlcNAc修饰已受到众多生命科学领域研究人员的关注。然而目前O-GlcNAc修饰的研究却远远滞后于磷酸化、乙酰化和泛素化等其它翻译后修饰,这是因为O-GlcNAc修饰具备化学计量水平低、糖苷键不牢固、修饰具有动态性和靶蛋白多为低丰度蛋白等多种特殊性质,为其研究方法的建立带来不便。因此,目前O-GlcNAc修饰研究的方法亟待完善。本文主要针对O-GlcNAc修饰的蛋白质的获得和O-GlcNAc修饰位点的确定这两个O-GlcNAc修饰研究的重要问题进行了方法探讨。 要阐明O-GlcNAc修饰对蛋白质功能的调节作用及机制,获得大量具有O-GlcNAc修饰的蛋白质至关重要。然而在真核细胞获得的O-GlcNAc修饰蛋白质会有磷酸化修饰等其它翻译后修饰的干扰,不利于研究O-GlcNAc修饰的功能,并且要从真核细胞中获得大量具有高度O-GlcNAc修饰的蛋白质成本很高,这成为研究O-GlcNAc修饰功能的难题。所以,在原核细胞和体外对蛋白质进行O-GlcNAc修饰将是解决这一问题的有效途径。 为了建立重组蛋白在原核细胞中O-GlcNAc修饰的方法,本文以可以被O-GlcNAc高度修饰的Sp1作为阳性蛋白,将Sp1与OGT在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达,验证了在原核表达系统中Sp1可以进行O-GlcNAc修饰,从而建立了重组蛋白在原核细胞中进行O-GlcNAc修饰的方法。连环蛋白p120在生理活动中扮演着多种角色,对与癌症相关的细胞活性(细胞粘连、活力、形态和生长)有重要影响。本实验室的前期研究发现p120的O-GlcNAc修饰在肿瘤发生和转移过程中可能发挥重要作用。因此本文利用建立的重组蛋白在原核细胞中进行O-GlcNAc修饰的方法对p120进行了修饰。结果表明,这种方法可以成功地应用于p120。但是实验发现,与真核细胞中p120相比原核细胞中p120的O-GlcNAc修饰水平较低,因此,本文对原核细胞中p120的O-GlcNAc修饰的方法进行了优化。实验结果表明,延长诱导时间、改变多种盐离子成分和含量、改变营养成分或加入葡萄糖及其类似物对p120O-GlcNAc修饰程度都没有显著影响。因为UDP-GlcNAc的浓度、OGT的浓度和反应体系对蛋白质O-GlcNAc修饰水平有重要影响,而在原核细胞中对这几项因素进行优化比较困难,因此我们推测将靶蛋白和OGT进行重组表达和纯化后在体外对靶蛋白进行O-GlcNAc会有效解决这些问题。我们以Sp1为阳性蛋白建立了重组蛋白在体外O-GlcNAc修饰的方法。实验结果证明,此方法也可以成功地应用于p120,且p120在体外的O-GlcNAc修饰水平显著高于原核细胞中p120的O-GlcNAc修饰水平。 确定蛋白质O-GlcNAc修饰位点对于阐明O-GlcNAc修饰对蛋白质功能的调节作用及机制是必须的。目前,质谱法以其简便性和可靠性成为确定O-GlcNAc修饰位点的首选方法。本文第二章便对质谱法确定O-GlcNAc修饰位点的方法进行了初步探讨。 本文要建立的确定O-GlcNAc修饰位点的质谱法流程如下:纯化的蛋白质经胰酶酶解成肽段后,将半胱氨酸上的巯基用氧化或烷基化的方式封闭,再经BEMAD(β消除和DTT的迈克尔加成)将O-GlcNAc修饰替换成DTT修饰,最后用硫醇柱富集具有DTT修饰的肽段并质谱检测。本文对质谱样品的前处理过程依次考察,确定了封闭半胱氨酸的方式、BEMAD的条件和BEMAD结合硫醇柱富集的可行性。从而为本实验室利用质谱法确定O-GlcNAc修饰位点奠定了基础。 综上所述,本文分别对O-GlcNAc修饰的蛋白质的制备和质谱法确定O-GlcNAc修饰位点方法进行了研究,建立了重组蛋白在原核细胞和体外O-GlcNAc修饰的方法,初步确定了质谱法确定O-GlcNAc修饰位点的样品处理条件。本文的研究将为O-GlcNAc修饰的研究提供有效工具。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q51

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