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《中国海洋大学》 2012年
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53bp2在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究与分析

刘成栋  
【摘要】:IGF信号通路在调控胚胎发育速度、控制成体大小和抵抗环境胁迫中发挥关键作用。IGF-1R及其下游调控因子也参与到肿瘤细胞的增殖、分化和转移过程。当IGF配体与相应受体结合后,需要募集并磷酸化胰岛素受体底物(InsulinReceptor Substrates,IRS))向下传递信号。IRS是IGF信号传导中的一个重要节点,因此与IRS存在相互作用的蛋白都有可能通过IRS对IGF信号通路发挥调节作用,从而调节细胞的增殖、生长、分化、迁移和调亡,并对脊椎动物的生长和早期发育起重要的调控作用。 53BP2(p53-Binding Protein2, p53结合蛋白2)又称为ASPP2(Apoptosis-Stimulating of p53Protein2,p53凋亡刺激蛋白2),是ASPP家族成员。该家族中ASPP2和ASPP1能够和与p53结合发挥促凋亡功能,而iASPP与p53结合后会抑制p53的凋亡活性。最近,Hakuno等(2007)通过酵母双杂交试验发现53BP2S(缺失N端122个氨基酸的53BP2异构体)可以在体外与IGF信号系统中IRS相互作用。那么53BP2能否通过调控IGF信号通路来控制动物的生长和早期发育,其作用的具体作用机制尚不清楚。 首先我们克隆得到斑马鱼53bp2基因,通过RT-PCR和in situ对其时空表达图谱分析,发现53bp2a和53bp2b为母源性基因,并在胚胎和成鱼中全身性表达。同时我们发现在斑马鱼中53bp2b的异构体--53bp2bi,53bp2b蛋白在C端缺失SH3结构域,在胚胎发育至24hpf后开始表达,并且表达部位局限在神经组织中。通过53bp2a和53bp2b的过量表达实验发现,过表达53bp2后胚胎的形态未发生改变,体节数目正常,但胚胎的体长变短,进一步研究发现该缺陷主要是由躯干部的长度减少所致。这些结果暗示了53bp2对肌节发育起一定作用。 PI3K-Akt和MAPK/Erk信号通路是IGF下游靶蛋白,它们在细胞存活,尤其是在细胞增殖分化中起重要调节作用。因此,我们利用Western Blot对Akt和Erk的磷酸化程度进行检测,发现过表达53bp2后Akt磷酸化受到显著抑制,但Erk的活性并未受影响。为进一步验证Akt与53bp2之间的关系,我们进行了共过表达实验,发现myr-Akt1可以营救由过表达53bp2引起的体长变短。这些结果说明53bp2是通过抑制Akt的磷酸化导致体长减少。 我们利用免疫共沉淀实验发现了斑马鱼53bp2与Irs1存在直接作用。这说明53bp2作用于IGF信号通路的直接靶点是IRS。53bp2蛋白具有保守的SH3和Ank repeat结构域,这两个结构域能够介导蛋白之间的相互作用。通过构建双结构域删除突变体,我们发现过表达53bp2-2Δ后不会改变胚胎的体长,并且Akt的磷酸化也未受到抑制。这些结果表明53bp2在体功能的发挥依赖于SH3和Ankrepeat结构域。 综上所述,53bp2通过直接作用于Irs-1抑制Akt的磷酸化导致胚胎体长减少。并且53bp2在体功能的发挥依赖于SH3结构域和Ank repeat结构域。我们的研究结果进一步完善了53bp2蛋白的复杂功能,探讨和研究了53bp2通过IGF信号通路调控胚胎早期发育的作用机制,取得了原始创新性的成果,同时为以53bp2为靶点进行抗肿瘤药物的设计和制定肿瘤治疗的策略提供重要的理论依据。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R96

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