几种食源性致病菌快速检测技术的建立

【摘要】：近年来，由于食品安全事件频发，食品安全问题越来越成为社会关注的热点。其中，食源性致病菌是引起食品安全问题的重要因素。金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌和溶藻弧菌是常见的食源性致病菌。目前检测食源性致病菌手段主要采用细菌分离、培养、生化鉴定等方法，操作繁琐，检测周期长，每次只能检出一种细菌，一般需要5~7天才能给出检测报告，且敏感度低、特异性差。因此研究食源性致病菌快速、准确检测方法以预防和控制食品安全事件的发生，具有重要的现实意义。 近年来，随着食源性致病菌的全基因序列的测定与分析，以及大量毒株部分基因序列的获得，越来越多的分子生物学技术以其快速、灵敏等优势得到了广泛的应用。本文根据以上提到的几种常见的食源性致病菌的保守毒力基因序列，分别建立了副溶血弧菌tdh基因的LAMP检测方法，五种食源性致病菌多重PCR检测方法，七种食源性致病菌基因芯片检测方法，为食源性疾病的快速诊断和预警监测体系的建立提供了重要的技术保障。 环等温核酸扩增技术是一种在等温条件下高特异性、高效、快速地扩增靶基因的DNA扩增技术。应用在线软件Primer ExplorerV4.0，针对副溶血弧菌特异性的毒力基因tdh基因设计LAMP引物。对反应温度和反应时间等参数进行了优化，同时将建立的LAMP检测方法与PCR方法进行了比较分析。结果表明，LAMP检测最适反应在60.8℃恒温条件45min内完成，凝胶电泳呈现梯形条带，与其他常见的细菌无交叉反应。LAMP检测方法的细菌DNA最低检出限为35.5fg/反应管，灵敏度较PCR高10倍，而且LAMP方法在1h内完成检测，操作简单，不需复杂仪器，用建立的LAMP方法对扇贝样品中分离菌株进行了检测表明， LAMP方法对检测致病性副溶血弧菌具有很好的可靠性。 多重PCR是在一个反应体系中加入了多对引物，在同一体系中对多个目的片段同时扩增。该方法克服了常规PCR及LAMP检测一次只能扩增一个目的片段的缺点。本文探索了一种同时特异性地检测五种常见食源性致病菌的多重PCR方法。根据目前食品中常见病原菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单核细胞增生性李斯特菌Listeriamonocytogenes、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidi、福氏志贺氏菌ShigellaFlexneri的相关毒力基因，选择具有特异性的副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因（thermolabile hemolysin gene,tlh）、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(heat stablenuclease gene,nuc)、单核细胞增生性李斯特菌的编码溶血素O基因hlyA、肠炎沙门氏菌的侵袭蛋白A基因(invasion protein A gene,invA)及志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因（invasion plasmid antigen H gene,ipaH），分别设计一对特异性引物进行多重PCR检测，对反应条件进行优化并评价了其特异性和灵敏度。通过对扇贝样品检测验证了此多重PCR体系具有很好的可靠性和实用性。 本文建立了基于多重PCR结合基因芯片技术同时检测副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、蜡样芽胞杆菌和溶藻弧菌的方法。选择副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因、单核细胞增生性李斯特菌编码溶血素O基因、沙门氏菌侵袭蛋白A基因及志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因进行五重PCR扩增，选择蜡样芽胞杆菌非溶血毒素基因（non-haemolytic enterotoxin operon, nheA）和溶藻弧菌类似Rposσ因子(Rpos-like sigma factor, rpoX)基因进行两重PCR，两组多重PCR扩增产物同时与芯片上的特异性探针杂交，检测7种食源性致病菌。采用该方法对15种细菌分别进行芯片检测，仅7种目标菌得到阳性扩增，显示阳性信号，说明该方法特异性高。通过实验验证，基因芯片检测致病菌的灵敏度较常规PCR高10倍。通过对38份实际样品检测验证了此基因芯片检测体系具有良好的可靠性和实用性。

【关键词】：食源性致病菌 环介导等温扩增 多重PCR 基因芯片 检测
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：TS207.4
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