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《中国海洋大学》 2012年
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菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)在苯并(a)芘胁迫下差异基因的筛选与分子生物标志物的研究

刘娜  
【摘要】:本文根据目前我国近海多环芳烃污染现状,以近海养殖重要经济贝类菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)为研究对象,克隆了菲律宾蛤仔芳烃受体介导的解毒代谢途径几种关键基因,包括芳烃受体蛋白(AhR)、芳烃受体核转位因子(ARNT)、热休克蛋白90(HSP90)。研究了毒性最强的多环芳烃(PAHs)——苯并(a)芘(BaP)对菲律宾蛤仔组织解毒代谢相关基因的表达调控规律,通过对在BaP胁迫下菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因的克隆及基因表达分析,探究双壳贝类PAHs解毒代谢机制;构建了菲律宾蛤仔PAHs消减cDNA文库,筛选、鉴定了差异表达基因,结合室内实验和海区现场验证,初步建立了基于菲律宾蛤仔的PAHs分子生物标志物监测技术,为海洋环境污染监测和水产品安全评价提供基础数据和技术支持。 1菲律宾蛤仔芳烃受体(AhR)介导的关键基因克隆与表达分析 菲律宾蛤仔芳烃受体蛋白(VpAhR)的cDNA全序列长2870bp,开放阅读框(ORF)长为2391bp,共编码796个氨基酸残基,不具备信号肽,属于胞内蛋白,含有2个核定位序列(NLS):K45RRRR49和P67SKRHRE73。BLAST分析表明VpAhR与其它物种AhR基因具有较高的同源性。VpAhR含有1个碱性螺旋-环-螺旋结构(bHLH domain)和2个配体结合区(PAS domain),属于bHLH-PAS转录因子家族。序列分析显示,VpAhR的配体结合区(a.a.220–383)与砂海螂(M. arenaria)和斑马纹贻贝(D. polymorpha)AhR的配体结合区相似性很高。实时定量PCR分析表明VpAhR在菲律宾蛤仔的鳃、消化盲囊、外套膜和闭壳肌中均有表达,鳃组织中表达量最高。 菲律宾蛤仔ARNT片段长485bp,编码161个氨基酸残基,该序列含一个由44个氨基酸构成的PAS结构域(a.a.7-50),该区域与其他物种ARNT的PAS结构域相似性较高;VpARNT在菲律宾蛤仔消化盲囊中表达最高,在鳃、外套膜和闭壳肌中也均有分布。HSP90是分子伴侣家族的重要一员,菲律宾蛤仔的HSP90基因片段cDNA长687bp,编码299个氨基酸,具有HSP90家族保守信号区(GVVDSEDLPLNISRE),与其他物种HSP90氨基酸序列具有很高相似性,与栉孔扇贝(C. farreri)和海湾扇贝(A. irradians)的相似性均为99%,菲律宾蛤仔HSP90在鳃组织中表达量最高;不同浓度BaP(0.01、0.2μg/L)染毒处理3d、10d,菲律宾蛤仔鳃组织中AhR、ARNT、HSP90和谷胱甘肽硫转移酶(GSTpi)的基因表达水平随染毒浓度增大和处理时间延长而逐渐升高;除10d时0.2μg/L组细胞色素P4504(CYP4)基因表达被极显著(P<0.01)上调外,其余处理组CYP4mRNA表达水平在染毒期间与对照组差异不显著(P>0.05)。实验结果表明,BaP与AhR介导的菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因AhR、ARNT、HSP90和GSTpi的mRNA表达具有明显的剂量—效应关系,符合生物标志物筛选原则,适于进行进一步的分析和现场验证。 2菲律宾蛤仔在苯并(a)芘胁迫下cDNA消减文库的构建与分析 利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了BaP(1μg/L)胁迫下菲律宾蛤仔正、反向cDNA消减文库,分别获得194个和93个重组克隆,测序分析显示,正、反向文库分别得到168个和83个EST序列,经同源序列相似性比对,正向cDNA文库中有31种基因与已知功能基因具有较高同源性,12种为假定蛋白,2种为未知蛋白;反向文库中已知功能基因10种,假定蛋白4种。所有ESTs序列信息均已提交Genbank数据库,cDNA消减文库编号为LIBEST_027169。进一步序列比对、功能注释及分类显示,通过SSH筛选到的菲律宾蛤仔差异表达基因主要为药物代谢、杂环化合物代谢、细胞分解代谢、抗生素响应等代谢过程相关基因。 3菲律宾蛤仔在苯并(a)芘胁迫下分子生物标志物的筛选与验证 设置一系列BaP染毒浓度(0.25、1和4μg/L),利用实时定量PCR检测染毒处理10d时菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因、SSH-selected差异表达基因及几种其他功能基因的mRNA表达。结果显示,测定的28种基因中Defensin、Serine protease、Thioesterprotein、GST C、Mn-SOD、ARNT等12种基因被BaP诱导表达上调,且与染毒浓度呈线性正相关关系,因此适于作为潜在的分子生物标志物进行进一步研究与验证。 在胶州湾和胶南附近海域各选择一个实验站点(S1和S2),于2011年12月采集各站点表层海水及菲律宾蛤仔样品。高效液相色谱法(HPLC)测定海水中PAHs含量和菲律宾蛤仔软体部中PAHs的累积量。结果显示,S1站点海水和菲律宾蛤仔组织中的总PAHs和BaP含量均高于S2站点;实时定量PCR分析表明,除HSP90和AhR外,PAHs含量较高的S1站点的其余10种分子生物标志物基因表达水平明显高于S2站点,表现出一定的剂量—效应关系。由此表明,菲律宾蛤仔12种基因基本符合生物标志物筛选原则,适于作为分子生物标志物用于海洋环境PAHs污染监测及毒性效应评估。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:X174

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