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《中国海洋大学》 2012年
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栉孔扇贝TGF-β/Smad信号通路基因的克隆、表达分析及生长性状相关SNP位点筛查

郭慧慧  
【摘要】:转化生长因子β (transforming growth factor β, TGF-β)超家族是一组具有结构相关性的多功能细胞因子,在细胞增殖、分化和生长等生物学过程中具有重要作用。TGF-β超家族成员首先与细胞膜表面的II型和I型受体结合,启动其信号传导,进而激活下游Smad蛋白,将信号传递至细胞核内,调节靶基因的转录。本文采用同源克隆、电子克隆等技术,对栉孔扇贝中TGF-β/Smad信号通路中11个基因进行了cDNA和DNA克隆,并运用生物信息学方法分析了各基因核苷酸和氨基酸序列特征;利用实时荧光定量反转录PCR (Real-time qRT-PCR)技术对11个基因进行了表达分析;通过重测序和EST数据库分析,筛查基因中的SNP位点,用高分辨率熔解曲线技术(High resolution melting, HRM)对所得SNPs在全同胞家系及野生群体中进行了基因分型,并开展了SNP与栉孔扇贝生长性状和基因表达的相关性分析,为扇贝TGF-β/Smad信号传导和相关基因功能的研究,及生长性状相关标记的开发和应用提供了参考。主要结果如下: 1.获得了栉孔扇贝TGF-β超家族配体Myostatin (MSTN)和Bone morphogeneticprotein2(BMP2)及抑制因子Follistatin的cDNA全长及DNA序列,确定了其基因组结构。MSTN和BMP2均由3个外显子和2个内含子组成,编码的氨基酸序列具有信号肽、前肽区、蛋白酶水解位点(RXXR)、C端成熟区等TGF-β超家族的典型结构域。对MSTN5’侧翼序列进行分析,发现了COMP、MEF2、MTBF和E-box等多个肌肉特异性调控元件。Follistatin由5个外显子和4个内含子组成,5个外显子分别编码信号肽、N端结构域和3个FS结构域。Real-time qRT-PCR结果显示,MSTN和BMP2除在原肠胚期有较高水平表达外,在其它胚胎/幼虫时期相对表达量均较低,Follistatin则在受精卵和4细胞期表达量较高;3个基因在所测各成体组织均广泛表达,其中MSTN在横纹肌中相对表达量最高,BMP2和Follistatin在鳃中表达量最高。HRM分析结果显示,MSTN中获得5个、Follistatin中获得1个具有多态性的SNP。位于MSTN5’侧翼序列的SNP位点g.-1163GT与一个全同胞家系扇贝壳长、壳高、横纹肌重等生长性状显著相关,其中TT型个体壳长、壳高、横纹肌重显著高于GT型个体(P0.05)。野生群体中高横纹肌量组TT基因型频率显著高于低横纹肌量组(P0.05)。Real-time qRT-PCR结果显示,上述全同胞家系中GT基因型个体横纹肌中MSTN表达量显著高于GG型和TT型个体(P0.05)。栉孔扇贝MSTN基因高表达量基因型与低横纹肌量基因型相同,提示了该基因可能对扇贝横纹肌的生长起负调控作用,与哺乳动物中MSTN在骨骼肌生长发育过程中的功能相符。 2.获得了丝氨酸/苏氨酸激酶受体基因Activin type II receptor (ActR2)、Activin-like receptor1(ALR1)、TGF-β type I receptor (TGFBR1)和BMP type I receptor(BMPR1)的cDNA全长序列,4个基因编码的氨基酸均具有膜外区、跨膜区、激酶区等TGF-β超家族丝氨酸/苏氨酸激酶受体的特征性结构。通过基因组数据库比对确定了ActR2和TGFBR1的基因组结构,分别由6个和10个外显子组成。检测栉孔扇贝胚胎/幼虫不同发育时期及成体组织中各基因表达水平,结果显示,4个受体基因均在受精卵、4细胞期和囊胚期有较高表达量,幼虫期表达量较低;各基因在所测组织中均有表达,且性腺和横纹肌中表达量较高。此外,在TGFBR1基因3’非编码区(untranslated region, UTR)筛得的SNP c.1815CT与一个全同胞家系扇贝壳长、壳高、横纹肌重等生长性状显著相关,TT型个体的上述三个性状显著高于CC型个体(P0.05)。Real-time qRT-PCR结果表明,该全同胞家系中CC型个体横纹肌中TGFBR1表达量显著高于TT型个体(P 0.05)。CC型扇贝个体横纹肌重最低而横纹肌中TGFBR1表达量最高,表明TGFBR1可能参与扇贝横纹肌生长的负调控,与哺乳动物中TGFBR1转导的TGF-β信号在肌肉生长中的负调控作用相符。 3.克隆得到了Smad家族Smad1、Smad3、Smad4和Smad6基因的cDNA全长序列,并确定了其基因组结构,分别包含7个、9个、5个和5个外显子。Smad1、Smad3和Smad6编码的氨基酸序列均由Smad蛋白家族典型的MH1和MH2两个结构域组成;但Smad4只含MH1结构域,MH2缺失。表达分析结果显示,栉孔扇贝胚胎/幼虫不同发育时期中,Smad1、Smad3、Smad4和Smad6均在原肠胚期有较高水平的表达,其它时期表达量较低;各基因在成体组织中广泛表达,Smad1、Smad3在横纹肌中表达量最高,Smad4在性腺中表达量最高,Smad6则在鳃中表达量最高。通过数据库比对在Smad3基因编码区筛得一个同义突变位点c.846GT,该位点与一个野生群体扇贝壳长、壳高、总重、软体重和横纹肌重等性状显著相关,GG型个体上述五个性状显著高于GT型个体(P0.05)。Real-time qRT-PCR结果显示,该野生群体中GT型个体横纹肌中Smad3表达量高于GG型个体。Smad3表达量最高的GT型扇贝个体横纹肌量最低,暗示了该基因可能抑制扇贝横纹肌的生长,与哺乳动物中Smad3转导的TGF-β信号参与细胞生长负调控的作用相符。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S917.4

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