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许氏平鲉和半滑舌鳎促性腺激素释放激素(GnRH)基因的克隆和表达分析

周晓苏  
【摘要】:促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH),是一种十肽神经激素,是作用于下丘脑-垂体-性腺轴的(HPG)关键分子。许氏平鮋(Sebastes schlegelii)有抗病力强、个体大、生长速度快、卵胎生等优势,已成为我国北方重要的养殖鱼类。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国近海的一种大型名贵的海水经济鱼种,具有生长快等优点。对这两种鱼类的GnRH及其受体的类型、分布和作用的研究可以为阐明GnRH对HPG轴的调控机制提供一定的理论依据。 (1)本研究通过同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术获得了许氏平鮋的3种以及半滑舌鳎的1种GnRH全长cDNA,通过生物软件分别对其进行预测分析,并利用实时荧光定量技术对这些基因在不同组织及发育时期的时空表达进行了研究: A.许氏平鮋GnRH-I cDNA序列全长424bp,ORF为288bp,包括61bp的5’UTR,36bp和3’ UTR。通过软件预测,该基因编码了一个含有96个氨基酸的蛋白质前体,分子量为10.4kDa,在该蛋白的N末端包含一个由22个氨基酸残基组成的信号肽。qPCR结果显示,GnRH-I在许氏平鮋雌雄成体的各9种组织中均有表达,其中在全脑组织和卵巢组织中表达量最高; B.许氏平鮋GnRH-II cDNA全长615bp,ORF为258bp,包括146bp的5’UTR和184bp的3’ UTR。预测其编码86个氨基酸,分子量9.6kDa,在该蛋白的N末端包含一个由23个氨基酸残基组成的信号肽。qPCR结果显示,除了在性腺与全脑组织外,GnRH-II只在许氏平鮋雌雄成体的心脏、脾、肌肉和肠中表达,仍以全脑组织和卵巢组织中表达量为最高; C.许氏平鮋GnRH-III cDNA全长506bp,ORF为273bp,包括45bp的5’ UTR和156bp的3’ UTR。预测其编码91个氨基酸,分子量10.1kDa,在该蛋白的N末端包含一个由23个氨基酸残基组成的信号肽。qPCR结果显示,GnRH-III只在许氏平鮋雌雄成体的性腺与全脑组织中表达;另外,利用qPCR分析发现许氏平鮋的GnRH-I、GnRH-II和GnRH-III基因在发育时期的表达均出现较大的波动性。 D.半滑舌鳎GnRH-III cDNA全长344bp,ORF为276bp,包括36bp的5’ UTR和32bp的3’ UTR。预测其编码92个氨基酸,分子量10.3kDa,在该蛋白的N末端包含一个由23个氨基酸残基组成的信号肽。qPCR结果显示,GnRH-III只在半滑舌鳎雌雄成体的性腺与全脑组织中表达;发育时期半滑舌鳎GnRH-III为 母源性表达,且其胚胎孵化前后波动较大。通过软件预测发现许氏平鮋3种GnRH以及半滑舌鳎GnRH-III都属于分泌型的蛋白,氨基酸序列比对分析表明以上预测出的GnRH前体氨基酸序列与其他硬骨鱼类的相似性均较高,显示出硬骨鱼类的GnRH基因在进化中的高度保守性。各组织qPCR表达分析显示以上GnRH均在与繁殖轴相关组织中的表达量较高,推测其在该物种的繁殖中有重要作用,可能参与整个繁殖过程。 (2)通过同源克隆和RACE技术获得长度为2359bp的许氏平鮋GnRHR-I全长cDNA,包含304bp的5’UTR、1281bp ORF和774bp的3’UTR,编码426个氨基酸。结构域预测表明许氏平鮋GnRHR-I含有7个跨膜结构域,属于G蛋白偶联受体家族,具有典型的G蛋白偶联受体特征:包含1个胞外N-末端尾巴、3个胞外loop、3个胞内loop、7个跨膜α螺旋以及1个胞内C-末端尾巴。qPCR分析显示,GnRHR-I mRNA在许氏平鮋雌雄成体的全脑组织和性腺组织中均有较强的表达,脾脏和肾脏中没有检测出信号,在其余6个组织中表达量均较低。 (3)通过染色体步移法对许氏平鮋3种类型的GnRH的启动子区克隆并分别对其进行生物信息学的预测分析:GnRH1、GnRH2和GnRH3基因启动子区域的序列长度依次约为4k bp,3.5k bp以及2.5k bp。在GnRH1和GnRH3的转录起始点TSS上游31bp处均有1个典型的TATAbox,GnRH2的TSS上游80bp左右有1个典型的GC box。在3个GnRH基因的启动子序列中,均存在Sp1、NF-1、Pit-1、C/EBP、CREB、Oct-1、GATA-1、Brn、USF和MyoD等转录因子,以及AR、ER、PR、GR、RAR和RXR等类固醇类核受体的结合位点,推测其对GnRH的调控起到关键作用。在GnRH1和GnRH2的启动子中还预测出TR和Olf-1结合位点,而在GnRH3不存在,推测这些转录因子对这3种不同类型的GnRH基因的调控存在特异性。此结果表明不同类型的黑鮶GnRH是受不同的机制调控的,从而在生理过程中发挥着不同的作用。 (4)构建了许氏平鮋GnRH-III的大肠杆菌表达系统:以pET32a为表达质粒,将GnRH-III cDNA序列(去掉编码信号肽部分的序列)插入其中构建了pET-32a/GnRH-III重组质粒,并在BL21(DE3)pLysS中得到了高水平表达。SDS-PAGE蛋白电泳分析发现重组质粒在相对分子量27kDa处出现一条特异条带,正好是标签蛋白相对分子质量(20.4kDa)与GnRH-III肽相对分子质量(7kDa)的总和,表明成功构建了pET-32a/GnRH-III融合蛋白重组原核表达系统,且以可溶性蛋白形式存在,为进一步从分子水平探讨pET-32a/GnRH-III融合蛋白的研究奠定了基础。


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