东海三种重要赤潮藻荧光定量PCR检测技术的建立和应用

【摘要】：荧光定量PCR技术（Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）是一种重要的分子生物学技术，可实时检测PCR扩增反应并对模板初始量进行定量分析，在基因突变和表达量检测、物种鉴定和定量分析等领域有着广泛的应用。本研究将荧光定量PCR技术运用到浮游植物的检测和定量分析当中，对东海三种重要赤潮藻——东海原甲藻、米氏凯伦藻和中肋骨条藻进行了研究，建立（或完善）了三种重要赤潮藻的荧光定量PCR检测技术，并将这一检测技术运用到东海现场样品的赤潮藻种类鉴定和数量检测中。主要成果如下： （1）以核糖体DNA的ITS区（内转录间隔区）为研究对象，分别设计了具有种特异性的东海原甲藻和米氏凯伦藻的引物和Taqman探针，并分别制备了含有东海原甲藻、米氏凯伦藻和中肋骨条藻ITS区片段的重组质粒。 （2）根据以上引物和Taqman探针，建立了以重组质粒作为标准品的东海原甲藻、米氏凯伦藻的荧光定量PCR检测方法；以重组质粒作为标准品，完善了本实验室之前建立的中肋骨条藻荧光定量PCR检测方法。以上三种方法均通过实验室制备的纯种和混合样品的检测，其特异性不受微小原甲藻、短凯伦藻和玛氏骨条藻等对照藻的干扰，检测限分别为4.2×10~2（东海原甲藻）、4.6×10~2（米氏凯伦藻）、4.3×10~3（中肋骨条藻）个细胞，可满足赤潮监测的需要。 （3）运用以上建立的方法，对在2011年4、6、8月采集自东海的现场样品进行了研究，并与显微镜观察结果进行比较。结果表明，该方法与镜检方法检测效果基本相同，可以准确、快速检测目标藻的存在与数量多少。

【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：Q948