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虾过敏原提取物量效关系的表征

吴丽莎  
【摘要】:虾是主要的经济甲壳类动物,也是经常报道的引起过敏反应的食用海产品之一。在虾过敏症的诊断和治疗过程中,对于虾过敏原提取物的制备、虾品种的选择以及虾过敏原提取物的贮存、量化等都尤为重要。本论文旨在建立虾过敏原的提取程序;对虾参考物进行选择;探讨储存时间和温度及冻融循环过程中虾过敏原提取物免疫原性变化以及解决方法;最后确立虾过敏原提取物活性的定量、定效、定性的表征方法。主要的结论如下: 1、虾过敏原提取物抽提方法的研究 采用七种不同的过敏原抽提液,对南美白对虾(Penaeus vannamei)的丙酮粉进行抽提,结果表明,加入DTT的1M KCl溶液提取的虾蛋白提取的蛋白浓度为12.35mg/mL;抽提出蛋白的条带有15条,并包括主要过敏原和次要过敏原;并且其与IgG结合的能力比纯水的高57.27%。因此,加入DTT的1M KCl溶液可以用于虾过敏原提取物的准备。 2、不同虾类过敏原提取物免疫原性的研究 选取不同的虾品种,对其抽提物的蛋白组成和免疫活性进行比较。发现南美白对虾的过敏原提取物中有15条蛋白条带,且与10位患者血清反应的免疫条带一共有43条;与其他虾品种的交叉反应率最高可达到87.78%。因此,确定南美白对虾是免疫活性最强且包含全部已报道致敏蛋白的品种,可作为过敏原蛋白的规范化参考物。 3、储存过程中虾过敏原提取物活性变化的研究 选取南美白对虾为研究对象,通过测定五周内蛋白的浓度变化、蛋白组成以及活性比较,来探讨过敏原提取物的最佳储存条件。实验结果表明,虾过敏原提取物在-20℃和-80℃储存五周时,主要过敏原条带不会发生降解;提取物的过敏活性保持不变;且蛋白浓度仅分别下降5.71%和5.00%。 4、冻融循环过程中虾过敏原提取物活性变化的研究 采用南美白对虾为研究对象,通过对比不同温度不同冻融次数下的蛋白浓度、组成以及活性变化,发现冻融循环五次时,-3℃,-20℃,-80℃的蛋白浓度分别降低24.21%、30.03%和33.08%;-80℃和-20℃的过敏原冻融循环三次时产生新的56KDa的蛋白条带,而-3℃冻融循环四次时才产生这条新的蛋白条带;且在-3℃,-20℃,-80℃冻融循环五次时,其活性分别下降52.37%、66.09%和21.31%。因此,提出过敏原检测试剂在应用时,应尽量减少冻融次数以确保实验结果的准确性。 5、抗冻剂的使用对虾过敏原提取物耐储性的影响 抗冻剂的使用对蛋白的浓度、组成和活性的保持均具有明显作用,且蔗糖和海藻糖的效果好于甘油,蔗糖和海藻糖的浓度在10%和20%时都能维持较好的效果。且在-20℃、-40℃和-80℃储存时添加抗冻剂,要比室温和0℃时添加的效果好。 6、抗酶解能力表征虾过敏原提取物的研究 以不同虾品种的过敏原提取物和不同提取液抽提的虾过敏原抽提物为研究对象,通过对比胃蛋白酶酶解前后虾过敏原抽提物的活性以及抗酶解的时间,得出蛋白提取物的抗酶解能力与蛋白跟IgE抗体结合的能力不相关的结论,即抗酶解能力的测定表征过敏原的活性不可行。 7、RBL-2H3细胞释放β-己糖胺酶表征虾过敏原提取物活性的研究 10ng/mL的蛋白提取物的浓度是激发细胞产生β-己糖胺酶的最佳浓度。不同虾品种过敏原提取物,激发RBL-2H3细胞产生β-己糖胺酶的量不相同,蛋白提取物激发细胞释放β-己糖胺酶的量和β-己糖胺酶释放率之间存在着线性关系,并确定南美白对虾的过敏原提取物的活性为6.09。 本文通过虾过敏原提取物的定量、定效和定性研究,确立了过敏原提取物的提取及使用程序,建立了过敏原提取物的活性表征方法,为过敏原提取物的进一步应用建立了基础。


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