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《中国海洋大学》 2012年
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龙须菜高温胁迫响应的钙调素信号传导途径的研究

张璇  
【摘要】:龙须菜是一种重要的产琼胶海藻,研究龙须菜的高温胁迫分子响应机理对于提高其高温耐受性,延长栽培期,提高产量具有重要意义。研究表明,钙-钙调素(Ca~(2+)-CaM)信号传导系统在植物的高温胁迫响应中起重要作用。本论文拟在前期通过对龙须菜进行高温胁迫下的SSH差异显示得到CaM的表达序列标签的基础上,首次克隆龙须菜的CaM基因及筛查到的其结合蛋白——肌醇-1-磷酸合成酶(MIPS)的基因,并研究其在高温胁迫下的表达模式,为探讨龙须菜对高温胁迫的响应机理打下基础,并为龙须菜耐高温品系的选育提供可用的基因信息。 本论文首先分别从野生型和981龙须菜中克隆得到多种钙调素(CaM)亚型基因。野生型龙须菜包含三种CaM亚型基因—cam1、 cam2和cam3,981龙须菜包含两种CaM亚型基因—cam1和cam2。其中,cam1在两种龙须菜中完全一致,其cDNA序列长度均为526bp,ORF长450bp,可编码150个氨基酸,其DNA序列长度均为832bp,含有4个外显子,3个内含子,cam1在两种龙须菜的基因组中均为单拷贝。而cam2在两种龙须菜中有所不同,其中野生型龙须菜cam2cDNA全长为600bp,ORF长447bp,可编码149个氨基酸,981龙须菜cam2cDNA全长为474bp,ORF长447bp,可编码149个氨基酸,两种cam2的DNA序列均无内含子,基因相似性为78%,其所编码的氨基酸序列的相似性为87%。cam3DNA序列长度为809bp,预测其具有2个内含子,3个外显子,预测的cDNA序列长度为447bp,但目前该基因只能从野生型龙须菜基因组DNA中扩增得到,无法从cDNA中扩增得到,推测cam3可能在转录过程中沉默。 采用荧光定量PCR的方法测定在28°C和32°C的热激条件下,981和野生型龙须菜不同CaM亚型的表达情况,发现无论是在28°C还是32°C的热激条件下,cam1在981龙须菜中的表达水平在整体上高于野生型龙须菜,表明981龙须菜的cam1在高温胁迫下能更有效表达,以传递热激信号,使得981龙须菜对高温的耐受能力更强。cam2在981龙须菜中的表达情况与cam1不完全一致,在28°C热激时,cam2的整体表达水平低于cam1,但在32°C热激条件下,两者表达情况相似,推测在981龙须菜热胁迫信号的传导过程中,CaM1可能为起主要作用的CaM亚型,而CaM2只有在981龙须菜处于温度更高、热激时间更长等更为苛刻条件下时才会上调表达,对CaM1起到有效的补充和辅助作用。此外,本实验发现野生型龙须菜的cam2只有通过巢式PCR反应才能够从其高温胁迫表达的cDNA中扩增出来,而不能通过一步PCR反应直接扩增到目的条带,可能由于其在cDNA中的拷贝量较低,因此无法利用荧光定量PCR对其热胁迫下的表达水平进行检测。相比较而言,981龙须菜中可能有更多的CaM参与热激信号传导,这可能与981龙须菜耐高温性更强直接相关。 据文献报道CaM自身并没有活性,只有活化后进一步与钙调素结合蛋白(CaMBP)的短肽序列结合,才能诱发其结构变化,从而共同调控信号传导途径,因此研究CaMBPs有助于探明钙调素介导的信号转导途径。本实验室前期通过酵母双杂交系统筛查获得了龙须菜CaM结合蛋白——肌醇-1-磷酸合成酶(myo-inositol-1-phosphate synthase, MIPS)的EST,本论文在此基础上扩增得到mips的cDNA和DNA序列全长,该序列在981龙须菜和野生型龙须菜中完全一致,且与其它物种mips具有较高同源性,其DNA序列全长为2067bp,无内含子,开放阅读框为1623bp,可编码540个氨基酸。对MIPS氨基酸序列分析,推测其CaMBD(CaM Binding Domain)为第212位至236位氨基酸,符合大多数CaMBD所具有的结构特征。将该MIPS与CaM进行酵母双杂交回复验证,证明MIPS与CaM存在相互作用,是龙须菜的一种钙调素结合蛋白。通过Real-TimePCR对32°C热激下981龙须菜和野生型龙须菜CaM与MIPS的表达量进行测定,发现其表达水平均呈现周期性上升趋势,但CaM与MIPS的表达趋势并非完全一致,可见MIPS虽然可能是CaM的一种下游结合蛋白,但其表达水平并未随着CaM的表达水平升高或降低,表明CaM可能不是MIPS唯一的上游激活物质,两种蛋白都具有独立的活性,共同在龙须菜抵御高温胁迫的过程中发挥作用。此外,981龙须菜MIPS的表达水平明显高于野生型,这可能与981龙须菜的耐高温特性直接相关。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S917.3

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