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《中国海洋大学》 2012年
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长期低盐胁迫诱导凡纳滨对虾肝胰腺差异表达基因的分析和鉴定

郜卫华  
【摘要】:凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)广泛分布于太平洋沿岸水域秘鲁北部至墨西哥桑诺拉一带,以厄瓜多尔最为集中。作为一种广盐性的甲壳动物,凡纳滨对虾可以适应0.5~40的盐度范围。近年来,为了缓解海水养殖对沿海环境的污染并推进内陆盐碱地区养殖的发展,淡化苗种在内陆的低盐度养殖已经成为了水产养殖的一个重要发展方向,但极低盐度下养殖的对虾存在着三个突出问题:生长速度慢、成活率低、免疫力低,对病原菌易感性增高,以上存在的现实问题制约了低盐度养殖的推广。开展长期低盐养殖对凡纳滨对虾的分子机理研究,不但可以为进一步为甲壳动物生理调节提供一定的理论依据,也为进一步从分子生物学水平进行相关的研究建立分子水平的检查平台。本研究利用抑制消减杂交技术构建了长期低盐诱导的凡纳滨对虾肝胰腺cDNA文库,对文库中拼接的序列进行了功能注释和分类,初步探明了长期低盐诱导后的凡纳滨对虾差异基因表达情况,并对筛选到的基因进行了长期不同低盐下转录水平变化的探讨,为从分子水平阐明长期胁迫机制奠定了基础。论文主要包括以下几方面内容: 1.首次利用SSH技术构建了长期低盐诱导下凡纳滨对虾肝胰腺差异表达cDNA文库。实验用凡纳滨对虾初始体重为(0.27±0.01)g,饲养于盐度2和30中56天,取样后构建肝胰腺不同盐度养殖下的消减cDNA文库,随机挑选200个(正向80个,反向120个)阳性克隆进行测序,成功获得179个(正向64个,反向115个)ESTs序列,拼接后得到73个Unigenes,包括19个Contigs(正向7,反向12)和54个Singletons(正向19,反向35)。将正向文库26条Unigenes和反向文库的47条Unigenes分别用BlastX和BlastN程序与GenBank上的非冗余蛋白数据库(nr)和非冗余核酸数据库(nt)进行比对分析发现,75.34%的Unigenes(55/73)与公共数据库中已知的基因具有同源性。生物学信息分析表明,这些Unigenes所代表的相应基因的功能包括免疫相关、代谢相关、核蛋白、细胞凋亡和转移蛋白。这些基因信息也表明凡纳滨对虾在长期低盐胁迫诱导后,导致的生理变化非常复杂。文库中排第一位的是免疫相关基因,占47.06%(8/17),其中有5个来自反向文库,即在长期低渗胁迫中,文库中的62.5%免疫相关基因下调表达,以上结果为低渗胁迫和对虾免疫力之间的关系提供了有利的间接证据,也为对虾淡化养殖的免疫性能研究提供了研究方向。构建的差异表达cDNA文库可较好的反映长期低盐胁迫对凡纳滨对虾影响的基因信息,以上结果丰富了甲壳动物环境胁迫研究的基因信息。 2.在长期盐度胁迫抑制性消减杂交文库构建的基础上,分析了反向文库编码血蓝蛋白、蜕皮类固醇调节蛋白、几丁质酶、胰凝乳蛋白酶1和胰蛋白酶5条基因mRNA表达量的变化情况,同时检验了这5条基因在短期盐度变化时(30→2/24h)mRNA表达量的变化情况。结果表明,反向文库中血蓝蛋白、几丁质酶、蜕皮类固醇调节蛋白、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶1基因转录水平下调表达验证了消减文库的构建是成功的。这5条基因mRNA表达量在胁迫24小时和56天后表达量变化明显不同,说明凡纳滨对虾对长期和短期盐度胁迫可能采取不同的应答策略,以上结果丰富了甲壳动物环境胁迫研究的基因信息。 3.在长期盐度胁迫抑制性消减杂交文库构建的基础上,探讨了长期不同盐度养殖对凡纳滨对虾(平均体重0.27±0.01g)生长性能和胁迫响应相关基因(血蓝蛋白、几丁质酶、蜕皮类固醇调节蛋白、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶1)转录水平的影响,以期从分子机理上了解凡纳滨对虾长期低盐养殖生长性能和生理状态的关系。结果表明,降低盐度到一定程度可显著降低凡纳滨对虾的生长性能和成活率;不同的基因存在不同的盐度诱导范围;相对于海水对照组,血蓝蛋白和胰凝乳蛋白酶1转录水平与盐度呈正相关,因此,以上几种基因转录水平反映长期盐度胁迫的强度。 4.本文利用SSH和RACE(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,克隆了凡纳滨对虾儿茶酚-氧位-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT,E.C.2.1.1.6)基因。该基因(LvCOMT)cDNA全长910bp(GenBank登录号:JQ345478),编码221个氨基酸,理论分子量74.9kDa,等电点4.98。经软件分析该成熟肽有12个磷酸化的氨基酸位点,不具信号肽,推测凡纳滨对虾COMT基因可能是依赖12个可能的氨基酸发生可逆的的磷酸化反应来进行调控作用的。LvCOMT基因与斑节对虾和中国明对虾的氧位-甲基转移酶具有高度的相似性,系统进化分析表明,LvCOMT在亲缘关系上更接近于哺乳动物的儿茶酚-氧位-甲基转移酶。应用RQ-PCR分析COMT在凡纳滨对虾中的组织特异性分布,结果显示COMT在肝胰腺组织中表达量最高,在鳃中的表达量最低。 5.克隆了凡纳滨对虾对盐度胁迫应答的重要伴侣蛋白基因——钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因(GenBank登录号:JQ682618)。LvCRT基因cDNA全长1866bp,编码406个氨基酸,具有保守的钙网蛋白家族标签(KHEQNIDCGGGYLKVF),信号肽(MKTWVFLALFGVVLVES)和保守的HDEL内质网回收标签。LvCRT基因与其它物种的钙网蛋白具有高度的相似性,系统进化分析表明,LvCRT在亲缘关系上更接近于昆虫的钙网蛋白。应用RQ-PCR分析CRT在凡纳滨对虾中的组织分布特异性,结果显示CRT在肌肉组织中表达量最低,在肠中的表达量最高。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S917.4

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【参考文献】
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