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《中国海洋大学》 2013年
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青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)ChTl和Lys基因的结构、表达和功能分析

许娜  
【摘要】:文昌鱼是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡物种,因此被认为是研究脊椎动物起源与进化的重要模式生物。文昌鱼的肝盲囊是脊椎动物肝脏的同源器官,参与文昌鱼免疫反应。本文从文昌鱼体内克隆出两种与文昌鱼先天性免疫相关的基因——类壳三糖苷酶基因和溶菌酶基因,并对这两类基因序列特征、表达情况和功能等相关内容进行了研究。在证明这两类基因与文昌鱼先天性免疫相关的同时,也为脊椎动物肝脏起源提供更多的实验依据。 壳三糖苷酶和酸性几丁质酶是哺乳动物18家族几丁质酶中的两个有活性的几丁质酶。哺乳动物壳三糖苷酶的相关研究比较多,但是较低等动物的壳三糖苷酶研究较少。本文用利用PCR和RACE技术得到了BjChTl (Branchiostomajaponicum chitotriosidase-like)全长cDNA,它长为1805bp,开放阅读框1503bp,5’-UTR93bp,3’-UTR209bp。BjChTl开放阅读框编码一个500个氨基酸的蛋白,分子量56.9kDa等电点为5.97。BjChTl基因氨基酸序列前17个氨基酸残基为信号肽,第29-399氨基酸残基是一个催化结构域,第406-423残基是铰链区,第448-500残基是几丁质绑定区,具备18家族几丁质酶的典型结构。对BjChTl基因氨基酸序列分析显示,BjChTl基因与脊椎动物几丁质酶的一致性为33-43%,与无脊椎动物几丁质酶的一致性为30-34%。另外,BjChTl基因氨基酸序列与哺乳动物壳三糖甘酶(chitotriosidase)和酸性几丁质酶(AMCase)氨基酸序列的一致性约为46%和41%。青岛文昌鱼BjChTl基因与佛罗里达文昌鱼BjChTl基因在氨基酸水平上有大约87.6%的序列一致性,这证明BjChTl基因在物种之间是非常保守的。比对BjChTl和其他物种的壳三糖苷酶以及酸性几丁质酶基因序列得知,BjChTl基因的中心区是保守的,多序列比对以及系统进化分析均表明BjChTl基因是壳三糖苷酶和酸性几丁质酶的共同祖先。基于青岛文昌鱼类壳三糖苷酶基因与佛罗里达文昌鱼类壳三糖苷酶基因很高的一致性,我们用佛罗里达文昌鱼类壳三糖苷酶基因的基因组信息与脊椎动物的壳三糖苷酶基因的基因组信息进行比较,发现脊椎动物的壳三糖苷酶基因有10-12个外显子,文昌鱼的有10个外显子,9个内含子,其中文昌鱼BjChTl基因的第2个外显子和第4个外显子有内含子插入现象。另外,文昌鱼BjChTl基因的每个外显子与脊椎动物壳三糖苷酶的每个外显子存在很好的对应关系。这些都证明壳三糖苷酶基因在进化过程中是很保守的,也证明壳三糖苷酶基因的转录调控在头索动物和脊椎动物之间是相似的。壳三糖苷酶可以分解几丁质,并被认为是杀伤含几丁质病原菌的免疫分子。重组人的壳三糖苷酶已经被证明具有降解几丁质和在体外抑制真菌生长的作用。我们采用表达完整的BjChTl和截短的BjChTl,来研究BjChTl的构-效关系。结果表明,像人的壳三糖苷酶一样,BjChTl也可以结合几丁质,水解人造的几丁质荧光底物4-methylumbelliferyl-β-D-N,N′,N″-triacetylchitotrioside,并能抑制真菌白色念珠菌的生长。这些都证明了BjChTl也是抑制真菌的免疫因子和具有几丁质分解活性的酶。BjChTl基因主要在肝盲囊和后肠中表达,推测BjChTl在体内可能行使消化几丁质的作用和通过抑制真菌生长参与免疫反应。有趣的是催化结构域重组表达蛋白BjChTl-CD的酶活性、抑制真菌能力和几丁质结合活性等都远小于完整的BjChTl蛋白,这证明几丁质结合结构域在青岛文昌鱼类壳三糖苷酶的免疫活性方面起着至关重要的作用。 溶菌酶有6种类型包括c型溶菌酶、g型溶菌酶、i型溶菌酶、噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶和细菌溶菌酶,其中c型、g型和i型是动物型溶菌酶。生物信息学分析表明,文昌鱼体内含有三种动物型溶菌酶,是现有物种中发现的唯一一个在同一物种体内同时具备三种类型溶菌酶的物种。因此,对文昌鱼溶菌酶结构、表达和和功能的研究具有独特的意义。文昌鱼g型溶菌酶全长1014bp,开放阅读框801bp,5’-UTR83bp,3’-UTR130bp,编码一个267个氨基酸组成的蛋白,N-端15个氨基酸为信号肽,其分子量为30.03kDa,等电点为6.3。c型溶菌酶全长651bp,开放阅读框423bp,5’-UTR60bp,3’-UTR168bp,编码一个141个氨基酸组成的蛋白,N-端17个氨基酸为信号肽,分子量为17.69kDa,等电点为6.64。 i型溶菌酶全长1053bp,开放阅读框501bp,5’-UTR56bp,3’-UTR496bp,编码一个167个氨基酸组成的蛋白,N-端21个氨基酸为信号肽,分子量为20.02kDa,等电点为7.84。多序列比对结果显示,这三种类型的溶菌酶均具有关键的催化活性位点,其中g型溶菌酶具有SLT结构域和底物结合位点,c型溶菌酶具有8个保守的半胱氨酸残基,但是文昌鱼i型溶菌酶中只有一个异构酶活性位点。文昌鱼g型溶菌酶与脊椎动物g型溶菌酶的一致性为32%-50%,与无脊椎动物的一致性为40%左右;文昌鱼c型溶菌酶与其它物种c型溶菌酶的一致性在31%-44%之间;文昌鱼i型溶菌酶与其它物种i型溶菌酶的一致性与亲缘关系有很强的相关性,即亲缘关系越近一致性越高。g型溶菌酶在基因组结构的进化方面变化较少;c型溶菌酶在进化过程中无脊椎动物第3个外显子中有内含子插入现象,但是内含子插入区域并不在催化活性位点区域;i型溶菌酶在物种进化过程中表现出退化趋势。g型溶菌酶和c型溶菌酶主要在肝盲囊和肠中表达,i型溶菌酶主要在鳃和脊索中表达。体外重组表达的蛋白均具有溶菌酶活性,证明这三种类型的溶菌酶都具有生物学功能,可能均参与文昌鱼的先天性免疫。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:Q75

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