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《中国海洋大学》 2013年
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即墨野生大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc)的营养评价及其胰蛋白酶抑制剂的研究

王旻  
【摘要】:我国是世界上野生大豆分布最多的国家。野生种拥有栽培种所缺乏的具有潜在应用价值的丰富变异,是作物改良的重要基因来源。野生大豆种子的蛋白质含量高于栽培大豆,野生大豆具有较强的抗逆性和适应能力可能与胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor, TI)在野生大豆中的表达量高于栽培大豆有关。鉴于野生大豆胰蛋白酶抑制剂(Wild soybean trypsin inhibitor, WSTI)的高表达及良好的生物学活性,认为有必要对其进行系统的研究。通过开展对即墨野生大豆资源的研究,本论文可为合理地保护和利用野生大豆这种生物资源提供一定的理论依据和数据资料。 本文首先对产自即墨的野生大豆进行了营养价值评价。通过凝胶过滤层析和亲和层析,借助建立的荧光分光光度法检测胰蛋白酶抑制剂活性,分离得到WSTI,并对其结构及性质进行了研究。提取野生大豆总RNA后,反转录后经巢式PCR扩增出WSTI目的基因测序并做生物信息学分析。主要结果如下: (1)以市售栽培大豆为对照,对即墨野生大豆的主要营养成分进行对比分析。结果表明:即墨野生大豆的蛋白质含量为40.74%,脂肪含量为16.91%,总糖含量为11.26%,与栽培大豆无显著差异;野生大豆含有较多的铁、钙元素,但锌、镁元素含量较低。野生大豆脂肪酸种类比栽培大豆少4种,但亚油酸和亚麻酸含量远高于栽培大豆;野生大豆氨基酸总量高于栽培大豆,其中谷氨酸含量最高,第一限制氨基酸为含硫氨基酸;必需氨基酸指数(EAAI)、生物价(BV)、营养指数(NI)和氨基酸比值系数(SRCAA)分别比栽培大豆高出5.41%、5.9%、1.02%和3.71%,说明即墨野生大豆营养成分全面且均衡,可作为优质蛋白质原料进行利用。 (2)对荧光分光光度法测定大豆胰蛋白酶抑制剂的条件进行优化。通过建立AMC标准曲线,得到抑制剂活力计算公式:U=(F-300.4)/1.19。该条件下测得的胰蛋白酶抑制剂浓度在0.1μg/mL~0.7μg/mL范围内,与反应速度存在一定的线性关系,检出限约为8.30ng/mL,适用于后续纯化过程中胰蛋白酶抑制剂的痕量检测。 (3)等电点沉淀法得到的WSTI粗品,其抑制剂活力为9.86U/mg,该值高于同法处理得到的市售栽培大豆抑制剂活性。先用Sephadex G-50凝胶过滤层析得到两个蛋白吸收峰,第二个峰W2峰有抑制活性,活力为54.69U/mg;再用Sepharose4B亲和层析得到一个吸收峰W23,活力为552.85U/mg;最后用Pellicon5000超滤膜进行浓缩,透析除盐及小分子杂质后,测得活力为672.06U/mg。样品经冷冻干燥,得到粉末状纯品WSTI。经上述几步分离纯化,纯化倍数可达68.16倍,活性回收率为44.46%。 (4)紫外光谱扫描显示WSTI在220nm和280nm处有最大吸收峰。WSTI具有较强的耐热性和耐酸碱性,对还原剂(DTT)耐受性较强,对其他变性剂,如尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇等,也有不同程度的耐受性,说明WSTI是一种稳定性较强的胰蛋白酶抑制剂。抑制动力学研究结果表明,WSTI为竞争性可逆抑制剂,抑制常数Ki为0.21μmol/L,远低于Km值,是一种抑制活性较高的抑制剂。高效液相色谱法分析可知,所得纯品WSTI包含两个峰,分子量分别为9.2kDa和23.0kDa,即Bowman-Birk型(BSTI)和Kunitz型抑制剂(KSTI),其中主要为B型胰蛋白酶抑制剂,而K型含量极少(约占5%)。采用MTT法,测定不同浓度的WSTI对肿瘤细胞增殖的影响,在0.1μg/mL-l mg/mL的浓度范围内,对A549肺癌细胞无显著性抑制效果。 (5)从野生大豆中提取出总RNA后反转录,再经巢式PCR扩增出KSTI和BSTI目的条带,扩增产物大小分别约为654bp和357bp。 即墨野生大豆KSTI基因序列的起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,与已报道的野生大豆及栽培大豆相似性均达99%。由217个氨基酸组成,相对分子质量为24031Da,理论等电点4.847。含有26个碱性氨基酸、31个酸性氨基酸、78个非极性氨基酸和82个极性氨基酸。氨基酸序列中含有STI家族的保守序列,其中80位的丝氨酸和90位的精氨酸构成其活性位点。二级结构主要由α螺旋、延伸链和无规则卷曲组成,无规则卷曲比例最大。 即墨野生大豆BSTI起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,与已报道的野生大豆及栽培大豆相似性均达99%。由118个氨基酸组成,相对分子质量为13016Da,理论等电点4.045。含有16个碱性氨基酸、12个酸性氨基酸、43个非极性氨基和47个极性氨基酸。氨基酸序列中含有BBI家族的保守序列,其中62位的苏氨酸和63位的赖氨酸构成其蛋白酶结合位点,Cys60、Thr61、Lys62、Cys68、 Cys87、Ala88、Leu89、Qln94、Cys95九个氨基酸残基构成其活性区。二级结构主要由α螺旋、延伸链和无规则卷曲组成,无规则卷曲比例最大。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S565.1

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