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副溶血弧菌细胞膜脂肪酸组成的气相色谱研究

徐敏  
【摘要】:副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)广泛分布于鱼、虾、贝类等海产品中,是沿海地区细菌性食物中毒的首要原因。致病性副溶血弧菌对人们的身体健康危害极大。准确快速鉴定食物中的副溶血弧菌是人们非常关注的问题,也是保证食品安全的一项重要任务。脂肪酸作为微生物标记物之一,已被广泛应用于细菌鉴定和群落生态分析中。本文通过气相色谱技术对副溶血弧菌细胞脂肪酸进行了较全面的分析,以期利用脂肪酸分布的种属特异性来分析鉴定副溶血弧菌,最终能够形成一个较完善的标准指纹图谱。研究结果如下: (1)通过平板筛选、PCR扩增及基因测序,我们从栈桥水域和第一海水浴场水域中筛选出了9株海洋细菌,其中有四株被鉴定为V. parahaemolyticus,三株为弧菌,另外两株未得到理想检测效果,可以将其忽略。 (2)在对脂肪酸衍生化条件比较优化的实验中,我们发现不同的皂化和甲酯化条件对脂肪酸的气相分析结果产生很大的影响。因此,合适的衍生化条件对于脂肪酸的分析时至关重要的。实验中以色谱峰的数量、色谱峰高和脂肪酸百分含量为参照指标:发现低温皂化利于增加色谱峰的数量和高度;高温甲酯化则易破坏长链及不饱和脂肪酸的结构,且时间越长,甲酯化效果越差。综合上述三个指标,得到较优的皂化和甲酯化条件:2mol/L NaOH-甲醇溶液2mL,70℃皂化反应10min;10%H2SO4-甲醇溶液2mL,70℃甲酯化反应15min。 (3)以一株V. parahaemolyticus为代表,研究了培养温度、培养基pH、培养时间及4℃低温环境对细胞脂肪酸组分的影响。结果表明,培养温度的升高利于饱和脂肪酸百分比的增加却不利于不饱和脂肪酸的合成。低pH环境中,短链脂肪酸(≤C15)的百分比明显高于长链脂肪酸(≥C16)的百分比;高pH环境中,现象正好相反。培养时间对不饱和脂肪酸的影响,主要表现在随着时间的延长,大部分不饱和脂肪酸的百分含量是减少的,只有C17:1是增加的;而饱和脂肪酸的百分比则随着培养时间的延长而增大。 4℃对大部分细菌来说是一个不良的生长环境。从4℃放置后的6d到24d,V. parahaemolyticus的活菌数不断下降,直至为零。这期间,脂肪酸也表现出相应的变化。进入4℃后,C12:0、C13:0、C14:0、C14:1和C15:0百分比出现下降上升再下降的反复变化,C18:1(9c)和C18:1(11c)百分比出现上升下降再上升的现象,C17:0和C17:1的百分含量则是一直下降。 (4)文中通过气相色谱技术对收集的15株海洋细菌的脂肪酸信息进行了采集。其中的8株V. parahaemolyticus的细胞脂肪酸具有非常类似的分布。它们含有的脂肪酸的种类基本相同,都存在C12~C18直链饱和脂肪酸、C14~C18的单不饱和脂肪酸以及少量支链饱和脂肪酸,在细胞中的百分比分别在28.23%~35.35%、57.48%~64.70%及1.19%~5.27%之间。C16:0、C16:1(9c)和C18:1(11c)为其优势脂肪酸,在细胞内的百分比占到77.74%~83.20%。 V. parahaemolyticus与另外7株海洋细菌在脂肪酸分布上则存在一定的差异。相对而言,同属于弧菌的菌株在脂肪酸组成上表现出较小的差别。绿脓假单胞(P.a)、嗜水气单胞(A.h)、腐败希瓦氏(YY)与V. parahaemolyticus在脂肪酸组分上的差异显著。以YY为例,其优势脂肪酸种类发生很大的变化,仅C16:1(9c)与V. parahaemolyticus的优势脂肪酸是相同的,另外两种是C13:0和12methyl14:0。三者在YY细胞中的百分比稍低,为65.34%。 (5)通过相似度分析和主成分分析,初步形成了以脂肪酸为基准的V.parahaemolyticus标准指纹图谱。以8株V. parahaemolyticus脂肪酸谱图的平均矢量为参照指纹图谱,对各样品指纹图谱进行相似度的解析,可以得出基础的结论:相关系数和夹角余弦的匹配值均大于0.980的样品,可归为V. parahaemolyticus;相关系数和夹角余弦的匹配值在0.900~0.980之间的样品可归为弧菌;而相关系数和夹角余弦的匹配值均低于0.850的样品可归为外属细菌。这个基础的结论可以用于V. parahaemolyticus的分类鉴别。


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