κ-卡拉胶酶基因克隆表达及酶法制备卡拉胶低聚糖工艺研究

【摘要】：κ-卡拉胶是存在于海洋红藻细胞壁中的一种结构性多糖，大量研究证实，κ-卡拉胶寡糖及其衍生物具有抗病毒、抗肿瘤、抗HIV、免疫调节等多种生理活性，具有较高的药用开发价值。毋庸置疑，酶解法具有特异性强、产物单一、反应条件温和等特点，因此，酶解法制备κ-卡拉胶寡糖是一种理想手段。但自然界分离得到的κ-卡拉胶酶产生菌酶产量较低无法满足生产需求。酶基因工程技术的发展为酶的定向改造提供了条件，拓展了酶的研究空间。本文采用基因工程技术对细菌来源的κ-卡拉胶酶基因进行异源分泌表达，以期实现酶产量的大幅提升，进一步拓宽酶的应用范围。研究结果如下： （1）经16s rDNA鉴定，野生的κ-卡拉胶酶产生菌属于Zobellia属并命名为Zobellia sp. ZM-2。应用Primer-Blast设计了三对引物FP1/RP1、 FP2/RP2、FP3/RP3扩增κ-卡拉胶酶基因，结果显示，采用引物对FP2/RP2可以扩增出单一的目的条带。所得κ-卡拉胶酶基因的ORF长度为1638bp，编码545aa，其中N-端的29aa为信号肽序列，基因所编码的氨基酸序列与现有序列的最大相似度为86%，可以确定为一种新的κ-卡拉胶酶基因，并命名为cgkZ。进一步比对分析发现，该酶具有GH16糖苷水解酶家族共有的催化结构E(I/L/V)D(I/V/A/F)(V/I/L/M/F)(0,1)E，说明该κ-卡拉胶酶也属于GH16糖苷水解酶家族。 （2）在获得cgkZ基因全序列的基础上，设计了带有限制性酶切位点BamH1和XhoI的引物，用来扩增包含有信号肽序列（cgkZ）和不带有信号肽序列（cgkZˉ）的卡拉胶酶基因。然后构建重组质粒pProEX-HTa-cgkZ及pProEX-HTa-cgkZˉ，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。结果发现，带有信号肽的重组菌BL21-HTa-cgkZ在保证胞内酶活力与不带信号肽的重组菌BL21-HTa-cgkZˉ基本相同的前提下，能将重组酶较多的分泌到胞外。为了使酶的产`量得到进一步提升，对重组菌BL21-HTa-cgkZ的胞外产酶条件进行了一系列的优化，确定了最佳的诱导条件（诱导温度23℃，IPTG浓度0.9mM，诱导时机2.5h）和培养条件（接种量1%，培养基pH5.5）。同时，培养基中添加0.5%乳糖或诱导后2h添加0.1%TritonX-100或0.5%Gly有利于胞外酶的进一步释放。生长产酶曲线表明，使用LB培养基进行培养的条件下，胞外酶活力最大可达9.37U/mL，最大周质空间酶活为6.06U/mL。综合来看，约51%的卡拉胶酶被分泌到胞外，33%的酶积累中周质空间中，远大于野生菌κ-卡拉胶酶的产量0.33U/mL，从而实现了κ-卡拉胶酶产量的大幅提升。 （3）SDS-PAGE分析发现，重组酶的分子量为45kDa，小于根据基因序列推定的分子量61.9kDa，推测可能存在一翻译后加工过程切除了部分片段。His-Tag的存在方便了蛋白纯化，采用Ni-琼脂糖亲和纯化的方法可得到较纯的重组蛋白。酶学性质的研究表明，重组酶的最适反应温度为39℃，40℃条件下保存1h酶活力损失50%，在35℃保存3h酶活力没有明显损失。重组酶的最适pH为6.0，在pH6.0~7.0条件下保存2h酶活力无明显损失。Na+、Tween-80、TritonX-100、DTT对重组κ-卡拉胶酶活力有明显的促进作用；Cu2+、Pb2+、EDTA对酶活力有明显的抑制作用，5mM Cu2+存在条件下可以使酶活力损失73.4%。ESI-MS分析降解后的卡拉胶寡糖发现，酶解产物中包含特征性的κ-卡拉胶四糖[A-G4s]2，六糖[A-G4s]3，八糖[A-G4s]4的电荷峰，其中六糖的电荷峰数量较多。红外分析结果显示寡糖的红外谱图中包含有848cm-1，929cm-1的强吸收峰，分别为κ-卡拉胶基本结构组成糖单元的特征吸收峰，进一步验证了所得卡拉胶寡糖为κ-型的卡拉胶寡糖。 （4）以耳突麒麟菜替代κ-卡拉胶为原料制备κ-卡拉胶寡糖。通过单因素实验确定了纤维素酶的作用条件：纤维素酶添加量2.1万U/g麒麟菜，酶解时间2.5h；κ-卡拉胶酶的添加量和酶解时间确定为6U/g麒麟菜和6h。在此基础上，采用Design-Expert7.0设计了三因素三水平的响应面分析实验，得出最佳的pH、卡拉胶酶添加量、温度组合：温度35.71℃，pH5.87，加酶量8.86U/g麒麟菜。在优化条件下对耳突麒麟菜进行降解，醇沉法收集制备卡拉胶寡糖，寡糖的得率在50%以上。该工艺大大促进κ-卡拉胶寡糖在食品、药品、保健品领域的应用。