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κ-卡拉胶酶基因克隆表达及酶法制备卡拉胶低聚糖工艺研究

刘哲民  
【摘要】:κ-卡拉胶是存在于海洋红藻细胞壁中的一种结构性多糖,大量研究证实,κ-卡拉胶寡糖及其衍生物具有抗病毒、抗肿瘤、抗HIV、免疫调节等多种生理活性,具有较高的药用开发价值。毋庸置疑,酶解法具有特异性强、产物单一、反应条件温和等特点,因此,酶解法制备κ-卡拉胶寡糖是一种理想手段。但自然界分离得到的κ-卡拉胶酶产生菌酶产量较低无法满足生产需求。酶基因工程技术的发展为酶的定向改造提供了条件,拓展了酶的研究空间。本文采用基因工程技术对细菌来源的κ-卡拉胶酶基因进行异源分泌表达,以期实现酶产量的大幅提升,进一步拓宽酶的应用范围。研究结果如下: (1)经16s rDNA鉴定,野生的κ-卡拉胶酶产生菌属于Zobellia属并命名为Zobellia sp. ZM-2。应用Primer-Blast设计了三对引物FP1/RP1、 FP2/RP2、FP3/RP3扩增κ-卡拉胶酶基因,结果显示,采用引物对FP2/RP2可以扩增出单一的目的条带。所得κ-卡拉胶酶基因的ORF长度为1638bp,编码545aa,其中N-端的29aa为信号肽序列,基因所编码的氨基酸序列与现有序列的最大相似度为86%,可以确定为一种新的κ-卡拉胶酶基因,并命名为cgkZ。进一步比对分析发现,该酶具有GH16糖苷水解酶家族共有的催化结构E(I/L/V)D(I/V/A/F)(V/I/L/M/F)(0,1)E,说明该κ-卡拉胶酶也属于GH16糖苷水解酶家族。 (2)在获得cgkZ基因全序列的基础上,设计了带有限制性酶切位点BamH1和XhoI的引物,用来扩增包含有信号肽序列(cgkZ)和不带有信号肽序列(cgkZˉ)的卡拉胶酶基因。然后构建重组质粒pProEX-HTa-cgkZ及pProEX-HTa-cgkZˉ,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。结果发现,带有信号肽的重组菌BL21-HTa-cgkZ在保证胞内酶活力与不带信号肽的重组菌BL21-HTa-cgkZˉ基本相同的前提下,能将重组酶较多的分泌到胞外。为了使酶的产`量得到进一步提升,对重组菌BL21-HTa-cgkZ的胞外产酶条件进行了一系列的优化,确定了最佳的诱导条件(诱导温度23℃,IPTG浓度0.9mM,诱导时机2.5h)和培养条件(接种量1%,培养基pH5.5)。同时,培养基中添加0.5%乳糖或诱导后2h添加0.1%TritonX-100或0.5%Gly有利于胞外酶的进一步释放。生长产酶曲线表明,使用LB培养基进行培养的条件下,胞外酶活力最大可达9.37U/mL,最大周质空间酶活为6.06U/mL。综合来看,约51%的卡拉胶酶被分泌到胞外,33%的酶积累中周质空间中,远大于野生菌κ-卡拉胶酶的产量0.33U/mL,从而实现了κ-卡拉胶酶产量的大幅提升。 (3)SDS-PAGE分析发现,重组酶的分子量为45kDa,小于根据基因序列推定的分子量61.9kDa,推测可能存在一翻译后加工过程切除了部分片段。His-Tag的存在方便了蛋白纯化,采用Ni-琼脂糖亲和纯化的方法可得到较纯的重组蛋白。酶学性质的研究表明,重组酶的最适反应温度为39℃,40℃条件下保存1h酶活力损失50%,在35℃保存3h酶活力没有明显损失。重组酶的最适pH为6.0,在pH6.0~7.0条件下保存2h酶活力无明显损失。Na+、Tween-80、TritonX-100、DTT对重组κ-卡拉胶酶活力有明显的促进作用;Cu2+、Pb2+、EDTA对酶活力有明显的抑制作用,5mM Cu2+存在条件下可以使酶活力损失73.4%。ESI-MS分析降解后的卡拉胶寡糖发现,酶解产物中包含特征性的κ-卡拉胶四糖[A-G4s]2,六糖[A-G4s]3,八糖[A-G4s]4的电荷峰,其中六糖的电荷峰数量较多。红外分析结果显示寡糖的红外谱图中包含有848cm-1,929cm-1的强吸收峰,分别为κ-卡拉胶基本结构组成糖单元的特征吸收峰,进一步验证了所得卡拉胶寡糖为κ-型的卡拉胶寡糖。 (4)以耳突麒麟菜替代κ-卡拉胶为原料制备κ-卡拉胶寡糖。通过单因素实验确定了纤维素酶的作用条件:纤维素酶添加量2.1万U/g麒麟菜,酶解时间2.5h;κ-卡拉胶酶的添加量和酶解时间确定为6U/g麒麟菜和6h。在此基础上,采用Design-Expert7.0设计了三因素三水平的响应面分析实验,得出最佳的pH、卡拉胶酶添加量、温度组合:温度35.71℃,pH5.87,加酶量8.86U/g麒麟菜。在优化条件下对耳突麒麟菜进行降解,醇沉法收集制备卡拉胶寡糖,寡糖的得率在50%以上。该工艺大大促进κ-卡拉胶寡糖在食品、药品、保健品领域的应用。


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