饲料调控大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）幼鱼生长、营养素感知与代谢及相关信号通路的初步探究

【摘要】：本研究以中国北方重要的海水养殖品种大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)幼鱼为实验对象,在室内流水养殖系统中开展摄食生长实验,研究摄食不同饲料对大菱鲆幼鱼生长性能、饲料利用、生理生化及营养素代谢的影响,并在此基础上探讨相关信号通路的调节机制。具体内容详见下文：1饲料中使用复合植物蛋白添加蝇蛆粉替代鱼粉对大菱鲆生长、营养素感知和代谢的影响本实验以初始体重为4.90±0.03 g的大菱鲆幼鱼为研究对象,旨在研究使用复合植物蛋白及其他动物蛋白替代鱼粉在大菱鲆饲料中的使用效果,并且探寻限制海水鱼饲料中替代鱼粉的主要因素。以全鱼粉组饲料为对照组,分别使用复合植物蛋白(豆粕、玉米蛋白粉、谷朊粉和花生粕)且添加(或不添加)少量蝇蛆粉(3%)来替代饲料中35%-40%的鱼粉,配置5种等氮等脂的饲料(即FM,35(0%),35(3%),40(0%),40(3%)，在室内循环水养殖系统中开展为期9周的摄食生长实验。在9周养殖试验结束时,除了40 (0%)组之外,其余的在35%和40%替代水平下的各替代组都与鱼粉组生长一致,且特定生长率达到3.0以上。在替代鱼粉后,大菱鲆的摄食率并未下降,表明复合诱食剂效果较佳。将蝇蛆粉添加到饲料中时,能够在35%鱼粉替代水平上改善饲料效率且在40%替代水平上提高了特定生长率和饲料效率：此外添加蝇蛆粉后还提高了饲料蛋白质的沉积率反映了蝇蛆粉在大菱鲆上的促生长效果。各组替代鱼粉后,鱼体肌肉中的功能性脂肪酸(ARA、EPA和DHA)含量都未发生显著改变,表明复合植物蛋白添加蝇蛆粉可以替代大菱鲆饲料中40%的鱼粉而不影响其生长和肌肉品质。40(0%)组的饲料干物质、蛋白质及能量消化率都低于对照组,且肠道的淀粉酶及蛋白酶活力也低于对照组,这表明了40(0%)组的幼鱼的消化酶活力变弱导致饲料消化率低,从而导致40(0%),组的特定生长率、增重率及饲料效率都显著低于对照组。分析鱼肌肉牛磺酸发现,在饲料中添加牛磺酸后肌肉中牛磺酸含量显著升高；血浆游离氨基酸组成分析发现,植物蛋白组血液羟脯氨酸含量显著低于鱼粉组而脯氨酸含量显著高于鱼粉组,表明了在大菱鲆幼鱼上存在脯氨酸与羟脯氨酸代谢之间的障碍,脯氨酸无法正常转为羟脯氨酸最终导致40(0%)组生长表现差。在此基础上添加了3%的蝇蛆粉(40(3%)组)后,大菱鲆幼鱼的生长表现与对照组一致,且消化率及消化酶活都有改善,血浆羟脯氨酸含量也有升高,表明了将蝇蛆粉应用于大菱鲆幼鱼饲料中的巨大潜在价值。进一步从分子及细胞信号通路等深层机制深入探究40(0%)组生长表现差的原因,TOR信号通路是生物体内感受营养素分子并调控下游蛋白质合成的最重要信号分子,发现本实验中各处理组的TOR及4EBP1的mRNA及蛋白表达表达量之间无显著差异,而TOR与S6的磷酸化蛋白水平在40(0%)组显著低于鱼粉组,表明40(0%)组的TOR信号通路激活受到抑制,蛋白质合成无法顺利完成,这是导致40(0%)组生长差的根本原因。本实验也证明了在鱼类上,TOR信号通路调节动物蛋白质合成及机体生长主要是在翻译后修饰(蛋白质磷酸化调节)水平,而非转录水平以及翻译水平上调节的。2饲料中添加不同种类及不同水平的含硫氨基酸对大菱鲆幼鱼自我合成牛磺酸的影响本实验中以初重为13.02±0.10g的大菱鲆幼鱼为研究对象,以酪蛋白和明胶为主要的蛋白源,旨在研究将不同种类及含量的含硫氨酸,如蛋氨酸(0.5%(MM).1.5%(HM)、半胱氨酸(0.3%(MC),0.6%(HC)).牛磺酸(1.5%(MT),2.5%(HT))添加到大菱鲆幼鱼饲料中,对其生长、组织牛磺酸含量及肝脏中牛磺酸合成关键酶mRNA表达及活力的影响。在饲料中添加蛋氨酸、半胱氨酸及牛磺酸都可以促进大菱鲆幼鱼的生长表现。饲料中添加蛋氨酸和半胱氨酸都可以提高大菱鲆的肝脏中CDO酶活活力，但是对mRNA表达水平无显著影响：由于大菱鲆肝脏CSD活力较低,处于检测的极限值附近,结果显示各种含硫氨基酸添加后肝脏中CSD活力无显著改变。饲料中添加蛋氨酸、半胱氨酸及牛磺酸显著增加了肝脏中牛磺酸的含量。这表明,大菱鲆具有一定的牛磺酸自我合成能力,可以通过饲料中添加含硫氨基酸来调节,但是该牛磺酸合成能力无法满足自身对牛磺酸合成的需求。3长期进食Rapa对鱼类生长、TOR信号通路活化、营养素代谢、肝组织连接及肠道细胞分化等的影响较高的蛋白需求是鱼类,特别是幼鱼生长中最重要的特点,这就需要饲料提供较高的蛋白水平以转为组织蛋白,这也使其成为水产养殖业最重要的成本来源。然而鱼类蛋白质合成的调节机制尚不清楚,特别是雷帕霉素靶蛋白(TOR)信号通路,在其他种类上已经证明是最主要的营养感知分子,在鱼类上作用机制尚不清楚。本研究中,我们研究了大菱鲆在用rapamycin长期处理后对于营养生理的影响。结果发现长期的TOR信号通路抑制会导致生长和饲料利用等都受到显著抑制。大菱鲆在长期的rapamycin处理后糖酵解显著降低而糖异生显著增加,肝脏脂生成的基因包括FAS(脂肪酸合成)、Dgat2(胆固醇合成)、Soat2 (甘油三酯合成)表达降低,与血浆胆固醇的含量降低一致,而Rapamycin长期处理后还导致大菱鲆肝脏照中的脂肪酸β-氧化显著升高。在Rapamycin长期处理后,肝脏组织间隙连接受到显著影响,这可能是由于肝脏中Connexin 43-蛋白表达的降低所导致的；Rapamycin长期处理还导致了肠道杯状细胞数目的增加。这都表明了mTOR信号通路在鱼类生长、代谢及组织结构中的重要调控作用。4饲料中使用亚麻油替代不同水平的鱼油对大菱鲆幼鱼生长、饲料利用营养素代谢的影响随着世界水产养殖的快速发展以及全球渔获产量的有限供给,通过植物油来替代水产饲料中的鱼油已经成为快速发展的趋势。然而,有关植物油替代鱼油后对于鱼类健康及机体代谢等方面的研究甚少报道。本研究以亚麻油梯度替代大菱鲆幼鱼饲料中的鱼油直至完全以亚麻油为脂肪源,结果发现当亚麻油替代鱼油的水平不高于2/3时候对于大菱鲆生长、饲料系数等无显著影响,鱼体蛋白的水平随着亚麻油含量的提高而逐渐降低,但是1/3LO组呈现出最高的鱼体脂肪水平。负责调控鱼类脂肪酸去饱和的FADS基因以及胆固醇合成的Soat2基因在亚麻油完全替代鱼油时候mRNA表达水平显著升高,而控制脂肪酸β-氧化的Cptla基因表达水平在全替代组出线显著降低；PPARa基因表达未受到饲料水平的显著变化,而SREBP1基因表达水平在部分替代时候显著降低但在全替代组反而恢复,类似于Soat2基因表达水平,也证实了SREBP1在参与调节胆固醇代谢中的重要作用。以上基因表达水平的改变也与血浆代谢物含量结果相一致,比如总胆固醇TCHO和高密度脂蛋白HDLC在低水平替代时候出现一定升高但是在全替代水平时候反而显著降低。血清中的AST活力随着替代水平的升高而不断升高,但是ALT活力并未发生显著改变。另外,血清中的LMZ活力在高水平替代组显著受到抑制而总SOD活力水平并未发生显著改变,血清总抗氧化活力也在全替代组显著降低。需要进一步研究鱼体营养素(脂肪酸)与免疫之间的调控关系。5一株海洋微藻在大菱鲆饲料中的应用前景评估本研究将—株海洋微藻添加到以亚麻油为主要脂肪源的大菱鲆幼鱼饲料中,评估对于大菱鲆生长、肌肉脂肪酸组成、脂肪代谢及机体免疫的影响。实验设置三个等氮等脂的饲料处理组,即鱼油组、亚麻油组以及亚麻油±裂殖壶藻处理组,每天早晚饱食投喂大菱鲆两次,开展为期九周的养殖实验。实验结束后发现,大菱鲆的增重率以及饲料利用效率都在亚麻油组出现显著降低,而在添加裂殖壶藻后恢复至鱼油组水平。鱼体肌肉脂肪酸组成中,n-3HUFA含量在亚麻油替代鱼油后出现显著降低,但是在添加裂殖壶藻后出现—定的恢复,尤其是DHA含量有较为显著的提升,但是仍然低于鱼油组的肌肉脂肪酸水平。肝脏中的脂肪代谢基因,如Cptla和LPL都在亚麻油组显著降低,而在添加裂殖壶藻后恢复至鱼油组水平,但是Dgatl并未发生显著改变。另外,血清中的ALP、CAT以及T-AOC活力等也都在亚麻油基础的饲料中添加裂殖壶藻后出现恢复。以上结果都表明,裂殖壶藻可以作为一种添加剂添加到植物油为基础的饲料中改善大菱鲆的生长表现、机体代谢以及免疫活力。