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与海水养殖相关的细菌多样性的研究及方法评价

李筠  
【摘要】: 为了探索微生物区系与养殖动物疾病的关系,进一步加强对海水养殖生物病原学的认识,更好地对疾病进行诊断,我们研究了两个育苗场不同发育期的中国对虾(P.chinensis)幼体和仔虾体内的异养菌和弧菌种群变动的动态过程。以典型特征法、BIOLOG GN法、数值分类法对菌株进行鉴定。结果表明,对虾幼体样品中所分离的细菌,大多是革兰氏阴性杆菌,经鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio)。弧菌属主要为溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harvevi)。在对虾幼体发育早期,假单胞菌(Pseudomonas)和气单胞菌(Aeromonas)占优势,随着对虾幼体的发育,在以后的发育过程中,弧菌(Vibrio)成为优势,其中溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)优势明显。且二者的消长与苗期病害的发生相关,溶藻胶弧菌总是在虾苗健康时出现或成为优势,而哈维氏弧菌成为优势时,苗期病害容易发生。从而揭示了育苗期中国对虾(Penaeus chinensis)幼体中可培养的异养细菌区系及其变化与病害发生的关系。 在上述研究基础上,采用BIOLOG-GN细菌鉴定系统,分析了来自5个国家的4个养殖对虾品种苗期及部分养成期虾体的185株弧菌(分别分离自对虾健康状态及发病期间)。结果表明,来源、种类不同的养殖对虾苗期的主要弧菌组成相似,溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(V.harveyi)是普遍存在的种类,同一种对虾在不同地区养殖,其区系组成略有差异。通常哈维氏弧菌(V.harveyi)为对虾苗期致病菌,副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)为成虾致病菌。在健康虾苗和发病虾苗体内都可分离到溶藻弧菌(V.alginolyticus)。因此,可以说明以中国对虾为研究对象得出的结论具有普遍意义。 为探索海洋环境中可培养细菌多样性的规律,直接比较研究了水产养殖、工业污染对海洋细菌多样性的影响。我们在1999-2000年间研究了青岛近岸代表性海区(养殖密集区、工业污染区、无污染区)不同样品中的异养菌(革兰氏阴性菌)的区系组成,对从青岛沿岸的养殖密集区、工业污染区、无污染区不同月份分离的428株革兰氏阴性细菌,用BIOLOG-GN法进行了鉴定,其中106株菌对BIOLOG-GN板的95种碳源反应结果全部为阳性或阴性,而其余的322株菌对BIOLOG-GN板的95种碳源反应结果正常。根据BIOLOG结果,对其中的322株菌进行4种比较分析:1.待测菌株、参考(或标准)菌株与BIOLOG-GN 与海水养殖相关的细菌多样性的研究及方法评价 数据库比较;2.根据95种碳源反应结果进行聚类分析;3.聚类分析结果与标 准菌株(27株)、BIOLOG毛N鉴定结果的比较;4.根据聚类分析结果,进行细 菌多样性评价。同时,也对BIOLOG一GN技术进行了评价。 以上研究表明,在近岸海水环境中,弧菌是可培养细菌中的优势种群。目 前,对弧菌科多样性的研究越来越集中到病原种类上,研究中发现弧菌科中仍 然有很多种群还没有被描述。AFLP方法在细菌属的多样性研究、分类学研究和 系统发育学研究等方面越来越起到非常重要的作用,于是出现了AFLP方法对 弧菌科菌株(其中76%来源于海水养殖环境)遗传多样性的报道,其中有一些 尚未定种群(即与现存的已定名的菌株不在一群中)。对此,我们选择了不能与 现有的弧菌标准菌株或参考菌株归入同一类群的部分独立聚簇,依据其165 rDNA全序列与标准菌株的比较结果,确立这些菌株在弧菌系统发育树中的地 位,找出亲缘关系最近的已知种的标准弧菌,并与之进行DNA一DNA杂交,进 一步确立这些聚簇的分类地位,以发现弧菌新的种类。研究结果表明,聚簇Al、 A3、AS、AS、A23、A51、A52与A53、A55、菌株LMG 21329、菌株LMG C21330 为有待于描述的新的弧菌种类。并对其中的A23和菌株LMG 21330、LMG21329 进行了表型特征的测定,包括脂肪酸组成、不同碳源的利用或发酵,以及弧菌 新种的命名与描述。A23命名为巧b川。xui sP.nov.,LMGZI犯9命名为风b对。 户aneiensis sp.nov.,LMG 21330命名为片b厂iogallicossp.nov.。


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