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《中国海洋大学》 2004年
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栉孔扇贝血细胞形态学研究和抗病功能基因的克隆

马洪明  
【摘要】:栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方重要的海水养殖种类。近年来频发的病害和大规模死亡给栉孔扇贝养殖业造成了巨大的损失。贝类的免疫防御主要依靠血细胞的吞噬作用和血淋巴中各种非特异的免疫活性因子的识别、调节和杀伤等作用。大多数学者将双壳贝类的血细胞分为两类:粒细胞和透明细胞。在一些种类也发现三种以上的血细胞。贝类体液中的非特异免疫防御因子目前发现的包括调理素、抗菌肽、类细胞因子样物质等。由于贝类没有基于淋巴细胞和抗体的获得性免疫机制,血细胞和非特异的体液因子构成了贝类抵抗病害感染的主要防线。本文研究了栉孔扇贝血细胞的形态,并尝试对体液免疫活性因子基因进行了克隆和筛选。 利用显微镜学和流式细胞术对栉孔扇贝血细胞进行了形态学研究和分类。超微结构观察显示有三种不同形态的细胞:Ⅰ型血细胞含有发达的细胞器如线粒体、高尔基体和粗面内质网,特别是细胞质中含有大量的囊泡结构,细胞器和囊泡结构向核区聚集,形成明显的内质和外质;Ⅱ型细胞含较少的细胞器和囊泡结构,较为电子透明,细胞器和囊泡在细胞中均匀分布;Ⅲ型血细胞具有较小的胞体和较大的细胞核,核质比高,几乎不含囊泡和细胞器。没有发现在其他双壳贝类中被广泛报道的粒细胞。注射酵母刺激后,Ⅰ型血细胞的数目显著增加,细胞质变得更加电子致密;Ⅱ型细胞的囊泡和细胞器亦有轻微增加;Ⅲ型细胞未见显著变化。流式细胞术(FSC v. SSC)显示三群细胞被清楚地分开:1)颗粒度高的大细胞,2)中等颗粒度的中等大小细胞,3)颗粒度低的小细胞。血淋巴中的平均血细胞数为2.03±0.43×10~7ml/l,三群细胞分别占58.0%,24.1%,17.9%。在玻片上充分伸展后,血细胞同样显出3种不同的伸展样式:分别命名为A,B,C型。A型血细胞折光性强,明亮;片状伪足伸展明显,且多从细胞之一端伸出。B型细胞折光性差,较暗;伪足刺突样。C型血细胞较暗,没有明显的伸展。伸展特征、电镜观察和流式细胞术分析的结果互相吻合,据此,可将栉孔扇贝的血细胞分为 栉孔扇贝Jfjl.细胞形态学研究和抗病功能基因的克隆 三类。 a2一巨球蛋白(a2一Macroglobulin,aZM)是存在于多种动物血浆中的一类大 分子糖蛋白,是重要的非特异免疫因子。作为广谱蛋白酶抑制因子,aZM通过结 合并抑制组织中内源或外源的过量蛋白酶为炎症和感染条件下的组织提供保护。 aZM还可以广泛地结合多种细胞因子、细菌内毒素、凝集素等分子,通过调节它 们的活性参与广泛的免疫防御和调节。aZM与高等动物补体因子C3、C4、CS的 结构相似性提示其可能在溶血过程中行使某种功能。目前己经在多种动物克隆了 aZM基因,包括几种节肢动物、线虫等。贝类中也发现了aZM活性并在少数种 得到了纯化蛋白,尚没有基因克隆的报道。根据aZM不破坏所抑制蛋白酶的活 性位点这一特性,利用血浆保护试验,首次证明了在栉孔扇贝和皱纹盘鲍(加tiotis discus hannai)中有aZM活性存在。在此工作的基础上,根据aZM序列同源性资 料,利用简并引物R子PCR,PCR Walk以及5,RACE和3,RACE方法克隆了栉 孔扇贝aZ巨球蛋白eDNA全序列(检索号:盯395573)。该基因全长64osbp 其中编码区sl57bp,5’端不翻译区18bp,3’端不翻译区1235bp(含polyA尾23bp)。 O邵编码1719个氨基酸,其中前16个氨基酸残基为信号肤序列,成熟蛋白质分 子量为192KDa,等电点为4.85。与来源于节肢动物赏(L imuluspolyPhemus)的 aZM具有最高序列相似性。栉孔扇贝aZM蛋白具有典型的aZM巨球蛋白的保守 性结构域。系统发育树分析显示人C3、C4、CS与无脊椎动物aZM具有比脊椎 动物aZM更近的进化距离。三维结构为:6段。一螺旋构成的内层a一螺旋桶和另6 段a一螺旋构成的外层a一螺旋桶形成aZM的结构核心,少量的p一折叠片和大量p 转角位于分子表面。利用Rl’- PCR方法分析了栉孔扇贝aZ巨球蛋白在不同组织 的表达情况。除血细胞外在其他检测组织外套膜、闭壳肌、性腺、肠等均未检 出 aZM表达。 抑制消减杂交(Sllppression Subtraetive Hybridization)是筛选差异表达基因 的有效方法。利用该方法筛选了栉孔扇贝血细胞在感染胁迫条件下的差异表达基 因。注射lx107酵母菌、大肠杆菌、溶壁微球菌的混合菌液胁迫栉孔扇贝10小时 后,分别抽取处理组和对照组的血细胞RNA反转录成cDNA,用Rsal酶切后连 栉孔扇贝血细胞形态学研究和抗病功能基因的克隆 接接头,制备成检测和驱动cDNA。经过两轮杂交和抑制性PCR扩增,将扩增产 物用T载体连接后转化大肠杆菌,构建了含800个独立克隆的差异表达cDNA文 库。对其中192个克隆进行了杂交鉴定,获得13个阳性克隆。测序后进行数据 库搜索分析发现,有6个克隆与其它动物的己知基因有较高的同源性,其中包含 与钙泵、转录因子ESE一3、溶血素等基因同源的克隆,这些基因已被证明与对抗 感染密切相关。另外7个克隆在GenBank数据库中无匹配序列。 肌动蛋白是高度保守的蛋白质,它在不同组织,以及同一组织的不同生理、 病理条件下具有相对恒定的表达量,因此在表达分析工作中常被用做参照物。由 于在栉孔扇贝中肌动蛋白基因尚未被克隆,为进行aZ
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S917

【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前4条
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4 王斌;γ-氨基丁酸对栉孔扇贝免疫防御的影响[D];鲁东大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前1条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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6 刘志鸿;海洋双壳贝类的免疫特性及调节[D];中国海洋大学;2004年
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8 蒲静;PRRSV对猪肺泡巨噬细胞天然免疫功能影响的分子机制[D];中国农业大学;2005年
9 林森;红细胞成分输血促进消化道肿瘤患者EⅡAF的实验研究[D];山东大学;2004年
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李子牛;栉孔扇贝(Chlamys farreri)幼虫发育期血细胞的发生研究[D];中国海洋大学;2010年
2 王建立;猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞模式识别受体转录水平的影响[D];中国农业科学院;2010年
3 何利华;鸭梨采后多酚氧化酶(PPO)同工酶及基因与果实褐变关系的研究[D];石河子大学;2010年
4 任晓亮;虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因的筛查[D];中国海洋大学;2011年
5 吴嫔赟;游泳运动对小鼠脾脏TLR2、TLR4诱导表达作用的实验研究[D];苏州大学;2011年
6 宫新城;孕酮对子宫免疫状态的影响[D];河北农业大学;2002年
7 李雷;人MBL的突变型哺乳细胞表达和野生型原核表达的研究[D];第一军医大学;2002年
8 王方勇;中国汉族、维吾尔族人群MBL基因第54位密码突变的研究[D];第一军医大学;2002年
9 苏伟;香蕉采后果实成熟特异表达基因的分离与鉴定[D];华南热带农业大学;2003年
10 杨翠华;胚胎着床期细胞因子及细胞凋亡的免疫调控[D];河北农业大学;2003年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李霞;孙虎山;王宜艳;李华;;柄海鞘神经复合体的显微观察[J];安徽农业科学;2009年04期
2 朱正生;郁杰;洪伟鸣;王妲妲;秦枫;魏体鳗;;γ-氨基丁酸·黄芪多糖复方对肉雏鸡生长及免疫性能的影响[J];安徽农业科学;2009年19期
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4 徐项桂,朱剑琴,陆勤,叶世鸣;离体小鼠胃切片高亲和性GABA摄取及其特性的研究[J];动物学报;1996年01期
5 徐项桂,杨再福,黄胜和,弋小红;γ-氨基丁酸对小白鼠离体胃标本胃酸分泌的促进效应(英文)[J];动物学报;2001年02期
6 张其中,吴信忠,高劲松,潘金培;近江牡蛎Hsc70蛋白基因cDNA片段的克隆及Southern杂交和RT-PCR分析[J];动物学报;2003年05期
7 张维翥,吴信忠,李登峰,孙敬锋;栉孔扇贝血液细胞的免疫功能[J];动物学报;2005年04期
8 方永强;文昌鱼生态习性及其资源的保护[J];动物学杂志;1987年02期
9 李华;孙虎山;王宜艳;李霞;;扁玉螺体表和消化系统甲硫氨酸脑啡肽免疫组织化学定位[J];动物学杂志;2008年04期
10 王宜艳;宋晓娜;付静芸;孙虎山;;贝类血细胞硫代黄素T荧光染色方法[J];动物学杂志;2011年06期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
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2 沙爱龙;孙虎山;王宜艳;;甲硫氨酸脑啡肽对短蛸血淋巴中两种水解酶活力的影响[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘志鸿;海洋双壳贝类的免疫特性及调节[D];中国海洋大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 徐文岳;大劣按蚊黑化包被约氏疟原虫免疫机理的研究[D];第三军医大学;2001年
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
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【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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10 孙虎山,王宜艳,杨静,孙修勤;病毒感染对栉孔扇贝血淋巴中过氧化氢酶和过氧化物酶活力的影响[J];水产科学;2004年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
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3 连姗姗;胡晓丽;张玲玲;包振民;;栉孔扇贝抗性选种相关生理指标的测定[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
4 邸炜鹏;王昭萍;于瑞海;张晨晨;;栉孔扇贝剥离卵的体外促熟研究[A];中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学会分会第十四次学会研讨会论文摘要汇编[C];2009年
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6 任伟成;蔡玉勇;王崇明;;栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒基因组全序列的测定与分析[A];中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学会分会第十四次学会研讨会论文摘要汇编[C];2009年
7 李莉;张国范;刘晓;郭希明;;栉孔扇贝夏季死亡相关标记研究[A];中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学分会第八次会员代表大会暨第十三次全国贝类学术讨论会论文摘要集[C];2007年
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9 齐占会;方建光;张继红;毛玉泽;蒋增杰;葛长字;;贝壳上污损生物的重量对栉孔扇贝生长和存活的影响[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第三卷)[C];2010年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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2 邸炜鹏;氨海水与5-羟色胺对栉孔扇贝解剖卵体外促熟作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
3 赵美丽;栉孔扇贝对石油烃蓄积及响应的初步研究[D];国家海洋局第一海洋研究所;2011年
4 秦贞奎;栉孔扇贝(Chlamys farreri)性别分化相关基因的筛选以及两个相关基因的表达分析[D];中国海洋大学;2011年
5 吴田田;栉孔扇贝(Chlamys farreri)甲腺原氨酸脱碘酶基因的克隆与功能的初步研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2012年
6 李子牛;栉孔扇贝(Chlamys farreri)幼虫发育期血细胞的发生研究[D];中国海洋大学;2010年
7 张晨晨;低渗诱导栉孔扇贝三倍体及与其它方法的比较[D];中国海洋大学;2010年
8 黄剑宇;栉孔扇贝大规模死亡致病病原研究[D];中国海洋大学;2003年
9 林娜;栉孔扇贝(Chlamys farreri)精巢细胞体外培养的初步研究[D];中国海洋大学;2011年
10 李昀;栉孔扇贝(Chlamys Farreri)两个卵黄蛋白原转录本的发育表达图式[D];中国海洋大学;2011年
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