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《中国海洋大学》 2004年
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酵母双杂交系统用于对虾白斑综合症病毒(WSSV)受体基因的筛选

王维新  
【摘要】:对虾白斑综合症病毒(WSSV)是对虾暴发性流行病的主要病原,严重危害对虾养殖业。病毒入侵宿主首先要和其对应的特异受体结合,深入了解WSSV感染机制,找到编码受体的基因,无疑对病害的防治具有基础性意义。本实验利用酵母双杂技术进行了受体筛选的初步研究工作。 作者利用SMART(Switching Mechanism at 5’ end of RNA Transcript)技术,以同源重组的方式构建了中国明对虾鳃细胞的全长cDNA文库。首先用RNA提取试剂盒从中国明对虾鳃细胞中提取总RNA,以总RNA为模板,CDS Ⅲ oligo(dT)为引物,反应一段时间后,再加入转换模板(switching template),继续反应,反转录合成cDNA第一链。再在DNA聚合酶下,通过长距离PCR,扩增双链DNA。双链cDNA经凝胶过滤柱纯化后,与线性化的pGADT7-Rec质粒载体同源重组,转化感受态AH109酵母菌株后,得到中国明对虾鳃细胞的全长cDNA文库。经测定该文库的容量为2.1×10~6,扩增后文库的滴度为7.3x10~7cfu/ml,菌落PCR测定,该文库的重组率为90%,可用于下一步的筛选研究。 对两个被认为有粘附活性的WSSV囊膜蛋白VP281、VP28做了融合质粒的构建。在WSSV全基因组中,针对VP28和VP281基因特定位点,用Primer Premier软件分别设计了一对引物,并引入Nde Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点,PCR扩增后,酶切、纯化,定向连接于载体pGBKT7,然后转化DH5α感受态细胞,经菌落PCR、酶切鉴定,确已有重组子。提取重组质粒分别转化AH109、Y187酵母感受态细胞,选择性培养基鉴定结果表明:VP281有自激活性,不能直接用于酵母双杂交系统;VP28无自激活性,可用于酵母双杂交系统。 用文库菌株和含VP28融合质粒的菌株做酵母融合,经TDO、QDO缺陷 酵母双杂交系统用于对虾白斑综合症病毒(WSSv)受体基因的筛选 型培养基筛选,最后得到6株阳性克隆。阳性克隆测序得到T3、TS两个cDNA 片段,大小分别为105 bp、360 bp。分析结果表明:这两个片段在GeneBank 中无相似序列,应该是新的基因片段,这为进一步找到完整的cDNA序列奠定 了基础。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S945.4

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