螺旋藻/节旋藻原生质球制备和RAPD分析研究

银红梅

【摘要】：原生质体(球)是生理研究和遗传育种的良好材料,原生质球的制备在节旋藻基因工程中也是不可缺少的实验手段。本论文论述了钝顶节旋藻FACHB341原生质球的制备方法,对已有的制备钝顶节旋藻原生质球的方法进行了改进。文中探索了节旋藻原生质球制备的最佳去鞘方法、缓冲液最佳pH值、最佳渗透稳定剂、最佳的酶组合以及溶菌酶的最佳浓度和酶解时间。实验结果证明,制备钝顶节旋藻原生质球需要将超声波法、离子法和酶解法相结合,其有利组合如下:取对数期(OD_(560)=0.6～0.8)的钝顶节旋藻FACHB341培养液,置于50mL离心管中进行超声波处理,能量为:3～5W,超声处理1.0s,间歇0.5s,处理2min。3000r/min离心10min,收集沉淀,置于含1.0～1.5mol/LNaCl的Zarrouk培养基中洗涤5min。3000r/min离心10min,收集沉淀,用无菌Zarrouk培养基洗涤2～3遍,3000r/min离心10min,收集沉淀。沉淀转入酶解液中。酶液组成为:0.2mol/L磷酸钾缓冲液pH7.2,渗透稳定剂KCl 0.8mol/L,0.5%溶菌酶。在28℃～30℃水浴低速震荡下酶解5～7小时,低渗爆破法检测原生质球,显微镜下计数细胞总数,经伊文思兰染色液活体染色每隔1.5小时计数原生质球数目,得出活体原生质球得率。此方法可以得到40%以上有活性的钝顶节旋藻原生质球,为节旋藻的进一步遗传转化以及基因工程研究提供了实验基础。同时本研究对本实验室保存的9株螺旋藻和节旋藻品系:钝顶节旋藻FACHB341、FACHB438、FACHB439、FACHB793、FACHBJP1、OUQDS_6、OUQDS8,极大节旋藻OUQDSM和螺旋藻FACHB351进行了随机扩增多态性DNA(RAPD)研究。为得到一个稳定的RAPD反应体系,首先对影响反应体系稳定性的主要因子进行了优化,优化结果为:在25μL反应体系中DNA模板用量50ng,Mg~(2+)浓度2.5mmol/L,引物浓度为2μmol/L,10mM dNTP 1μL,Taq聚合酶1U。反应程序:94℃预变性10min,然后94℃ 1min,36℃ 1min,72℃ 2min,40个循环,最后72℃下延伸10min。电泳条带按照Nei-Li法公式S=2Nxy/(Nx+Ny)获得各样品间的相似性,再用D=1-S获得相应的遗传距离,应用Phylip软件包

【关键词】：螺旋藻 节旋藻 原生质球 RAPD 聚类分析
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：Q943.2
【目录】：

第一章前言8-31
1 螺旋藻/节旋藻概述8-14
1．1 螺旋藻/节旋藻的研究历史、生态、形态结构及生活史9-11
1．2 节旋藻的营养价值和药用价值11-14
2 植物和藻类原生质体的研究和发展14-18
2．1 原生质体概述14-15
2．2 原生质体的研究历史15-18
3 遗传标记研究概述18-27
3．1 形态标记18-19
3．2 细胞学标记19
3．3 生化标记19-20
3．4 分子标记20-27
4 本论文的研究目的和意义27-31
4．1 制备钝顶节旋藻原生质球的目的和意义27-29
4．2 螺旋藻/节旋藻RAPD分析研究的目的和意义29-31
第二章钝顶节旋藻原生质球制备31-42
1 材料与方法31-34
1．1 材料31-32
1．2 实验主要仪器32-33
1．3 方法33-34
2 结果和分析34-40
2．1 两种去鞘方法对钝顶节旋藻 FACHB341原生质球得率的影响35-36
2．2 不同渗透稳定剂对钝顶节旋藻 FACHB341原生质球得率的影响36-37
2．3 磷酸钾缓冲液pH值对钝顶节旋藻FACHB341原生质球得率的影响37-38
2．4 溶菌酶浓度对钝顶节旋藻 FACHB341原生质球得率的影响38
2．5 溶菌酶和果胶酶及单独溶菌酶对钝顶节旋藻 FACHB341原生质球得率的影响38-40
3 讨论40-42
第三章螺旋藻和节旋藻的 RAPD分析研究42-58
1 材料与方法42-46
1．1 材料42-43
1．2 藻种的采收43
1．3 基因组 DNA的提取43-44
1．4 基因组 DNA浓度的测定44
1．5 常用仪器44
1．6 缓冲液及其试剂44-45
1．7 RAPD反应45
1．8 数据处理45-46
2 RAPD实验条件的确定和优化46-49
2．1 Mg~2+浓度46-47
2．2 模板 DNA浓度47-48
2．3 引物浓度48-49
3 结果49-56
3．1 DNA的提取49-50
3．2 RAPD图谱分析50-54
3．3 聚类分析54-56
4 讨论56-58
总结58-61
参考文献61-72
致谢72

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