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《中国海洋大学》 2005年
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应用双特异分子探针技术对圆海链藻(Thalassiosira rotula)进行定性定量检测研究

李秀芹  
【摘要】:对海洋浮游植物进行分离、纯化、种类鉴定和定性定量检测是浮游植物研究中最重要的工作之一。对于浮游植物的检测与鉴定,传统的研究方法为形态学观察,随着现代科技的发展,一些先进的技术已经应用到浮游植物检测中,比如核酸杂交技术、分子免疫技术、实时荧光定量PCR及流式细胞术,另外HPLC技术也应用到浮游植物检测中来。目前利用分子生物学技术已经可以直接对单个浮游植物细胞进行操作。当前研究的热点是应用核酸探针技术对浮游植物进行定性定量分析,特别是原位杂交和三明治杂交在浮游植物检测中应用比较广泛。 本研究对圆海链藻进行了DNA的提取与纯化、rDNA序列扩增、克隆与测序;并基于一种全新的浮游植物检测技术——双特异分子探针技术,设计出一套分子探针;通过对各探针的使用浓度、探针标记方法的选择、酶切温度对特异性的影响以及样品与处理方式对检测信号的影响等实验条件的探讨与优化,建立了圆海链藻的稳定可靠的定性定量检测方法;通过核酸酶降解实验验证了该技术中与寡核苷酸探针进行杂交的靶物质主要是RNA;并进行了该方法的探针特异性实验、标准曲线的建立以及模拟样品的检测;另外对藻细胞保存方式对检测信号的影响以及整个细胞生长周期内检测信号的变化进行了探讨。 研究结果表明,扩增所得到的圆海链藻核糖体小亚基基因序列长为1787bp;经过特异性验证,证明本研究设计的针对圆海链藻的双特异分子探针(抓捕探针、S1探针、连接探针和信号探针)具有很好的特异性,能鉴定到种;对RNase和DNase处理前后的信号值进行的比较实验结果证明,在液相体系中与寡核苷酸探针特异杂交的目的核酸大部分为RNA;样品预处理方式对结果的影响实验证明,细胞裂解液直接杂交较之提纯RNA后杂交方法要快速、简洁、稳定的多,故接下来的实验中选择细胞裂解液直接杂交方法:按照前面所建立的实验方法建立的圆海链藻检测标准曲线方程为y=0.0019x-0.0284,其中x代表目的细胞数,y
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q948.8

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【引证文献】
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1 段亚丽;基于色素荧光的浮游藻识别测定技术研究[D];中国海洋大学;2012年
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【参考文献】
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【共引文献】
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9 曹春晖;两种赤潮藻对锰的生理生态响应[D];中国海洋大学;2010年
10 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
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5 黄辉;哈维弧菌表面抗原的克隆和真核表达[D];华中农业大学;2010年
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8 刘源;猪胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统ΔnarQ/narP突变株构建及功能研究[D];华中农业大学;2010年
9 李善文;蟾蜍灵对大鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡的影响[D];南京医科大学;2009年
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【同被引文献】
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4 张前前;东海典型赤潮藻检测的荧光光谱特征研究[D];中国海洋大学;2005年
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3 苏德胜;基于双特异分子探针技术的赤潮藻自动化分析仪研制[D];中国海洋大学;2005年
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7 宋红杰;固定化联吡啶钌电化学发光及其在药物分析中的应用[D];陕西师范大学;2007年
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9 栾青杉;长江口及其邻接水域浮游植物群集生态学研究[D];中国海洋大学;2007年
10 张照薪;基于C8051F单片机和CANbus的航空三轴伺服转台控制系统的设计与研究[D];太原理工大学;2008年
【二级参考文献】
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