中国地方绵羊品种PRNP基因研究

【摘要】： 绵羊PRNP的多态性与绵羊对痒病的易感性有关,特别是PRNP 136,154和171位点。从我国10省份采集了24个我国主要地方绵羊品种的血液样品668份,提取绵羊基因组DNA,用PCR方法扩增绵羊PRNP基因,通过序列测定,对它们的PRNP基因多态性进行分析,以确定PRNP的多态性情况以及这些绵羊品种对痒病的感染风险。研究发现了PRNP编码区21、85、101、112、127、138、141、143、146、153、154、171和189一共13位点的基因多态性,其中21、85和143位点的多态性为首次发现。值得注意的是,在本次研究中没有发现136位点丙氨酸(A)/缬氨酸(V)的多态性,136位点均为纯合的A。而154位点精氨酸(R)/组氨酸(H)的多态性与先前的研究一致,H的多态性也比较少。在171位点发现了谷氨酰胺(Q),R,H或赖氨酸(L)四种多态性变化。由于易感等位基因ARQ的等位基因频率高达78.14%,所以调查的羊群对于感染痒病均存在较高的风险。 根据绵羊PRNP基因序列设计了针对407、461、512和513位点SNP多态性的上下游引物和探针,建立了检测绵羊PRNP136、154、171位点基因型的TaqMan探针Real-time PCR方法。本方法用于检测绵羊PRNP基因型具有简便快速,结果直观,容易判读等优点,可以用于大量绵羊样品的PRNP基因分型,适合于在大部分具有标准设备的分子生物学实验应用。用本方法检测了200份藏羊的PRNP基因型,结果发现藏羊的PRNP基因型主要为ARQ/ARQ,其次为ARQ/ARR,还有少量的ARQ/VRQ,ARQ/AHQ基因型。 根据Genbank中绵羊PrP基因全序列和表达载体pET28a载体和pFMDHZ-α-A的多克隆位点设计了针对绵羊PrP前体蛋白基因引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增绵羊PrP前体蛋白基因,通过酶切、连接,将本基因克隆到原核表达载体pET28a(+)和真核表达载体pFMDHZ-α-A中,构建了重组原核表达载体pET28a-OPrP和真核酵母重组表达载体pFMDHZ-α-A-OPrP。将重组质粒pET28a-OPrP转化E.coli BL-21感受态细胞,用IPTG诱导表达。将重组质粒pFMDHZ-α-A-OPrP经电转化转入多形汉逊酵母中,随后通过甲醇诱导进行表达。通过PAGE电泳和Western-blot鉴定表达的绵羊PrP前体重组蛋白。为TSE的检测及诊断、PrP的结构与功能研究奠定基础。