钝顶螺旋藻/节旋藻藻蓝蛋白的提取纯化及抗肿瘤免疫效应研究

【摘要】： 从海洋生物中寻找高效、低毒副作用的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的新领域。近年来,随着海洋生物药学研究的不断深入,发现许多海洋生物尤其许多藻类,其体内含有各种特有药物功能。其中钝顶螺旋藻(Spirulina platensis,又称钝顶节旋藻Arthrospira platensis)中的藻蓝蛋白(C-phycocyanin, CPC)以其特有的营养和保健价值受到广泛的重视。因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点,CPC被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。带有荧光,可用作荧光标记物。另有研究表明藻蓝蛋白具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、清除自由基和保肝、降血脂等生理活性,这为螺旋藻在功能性食品和药品领域的开发提供重要的决策依据。目前有关藻蓝蛋白抗肿瘤免疫机理的研究国内外报道较少,本课题研究的主要目的旨在揭示藻蓝蛋白发挥作用的深层机理,以期更深层次的发挥其应用价值。 首先对钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的提取和纯化方法进行了改进。采用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超生波破碎法,50%硫酸铵沉淀获得CPC,提取率达到13.1%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱(HA)层析和sephacrylS-200HR凝胶层析对其进行纯化,纯度达到4.71%。纯化后的CPC在12% SDS-PAGE中得到两条带,分别是α和β两个亚基,分子量分别为21.4ku和17.0ku。结果表明,通过上述分离纯化过程得到了较高提取率和电泳纯度的CPC。 然后我们对CPC的抗肿瘤免疫活性进行了研究。主要包括5个方面:①CPC的体外抑瘤作用研究:检测CPC对人宫颈癌细胞(HeLa)、乳腺癌细胞(MCF)、胃癌细胞(NKM)、卵巢癌细胞(SVOA)、人胚肺细胞(HEL)体外生长的影响。在体外培养条件下用不同浓度的CPC(终浓度为20,40,80,160μg/ml)处理这4种癌细胞和1株正常细胞,运用MTT法检测CPC对细胞生长的影响。结果显示CPC对这4种癌细胞均有不同程度的抑制作用,并存在浓度剂量效应,高浓度抑制作用强,但对正常细胞无明显影响。②CPC诱导HeLa细胞凋亡的分子免疫机理探讨:通过流式细胞仪检测CPC对HeLa细胞的细胞周期变化的影响,结果发现出现一个亚二倍体峰(G0/G1);电镜检测细胞的凋亡形态;琼脂糖凝