青岛文昌鱼体液酚氧化酶：分离、纯化、鉴定、诱导形成及其基因克隆

【摘要】： 酚氧化酶(phenoloxidase)又称为酪氨酸酶(tyrosinase , EC1. 14. 18. 1)。它是一种含铜的酶,能够催化单酚羟化成二酚(如多巴),把二酚氧化成醌;醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素(Lerch K,1988)。酚氧化酶在脊椎动物和无脊椎动物中得到了广泛的研究,然而在进化上占据关键位置的文昌鱼中的酚氧化酶的研究却比较少。我们实验室以前的研究证实文昌鱼皮肤粘液中存在酚氧化酶和酚氧化酶原,并对其组织分布和抗菌活性及其在胚胎发育过程中的变化进行了研究。然而,在文昌鱼体液中是否存在酚氧化酶(一种可能在文昌鱼的免疫和防御系统中担任重要角色的酶),目前还不清楚。 我们以青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)为实验材料,首先,用分光光度法和电泳与生化染色相结合技术检测,发现酚氧化酶存在于文昌鱼体液中,且主要以酶原形式存在;其最适温度是30℃-35℃,最适pH是7.0-7.5。酚氧化酶原可以被外源性激活剂如胰蛋白酶、酵母聚糖和脂多糖激活;在10 mM钙离子存在,外源激活剂引起的激活作用明显增强。但是外源激活剂引起的激活作用可以被蛋白酶抑制因子(STI和pNPGB)所抑制。另外,非变性电泳结合酶特异性染色证明酚氧化酶分子量约150 kDa,变性后为三条带,其分子量约44、46和72 kDa。这是有关对头索动物文昌鱼体液中存在酚氧化酶和酚氧化酶原的首次报道。 为进一步研究文昌鱼体液中酚氧化酶的特性,我们用硫酸氨分级沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析三种分离纯化技术相结合,从文昌鱼体液中纯化出了酚氧化酶。纯化的酚氧化酶用非变性电泳显示一条分子量约150 kDa的带,而变性后为三条带,其分子量约44,46和72 kDa。这说明文昌鱼体液中的酚氧化酶可能是一个通过二硫键连接的异三聚体蛋白。底物特异性和抑制剂实验的研究证明文昌鱼体液中酚氧化酶氧化o-diphenols(如Dopamine和 4-methylcatechol)的活性较强,而氧化p-diphenols(如Hydroquinone和Methylhydroquinone)的活性较弱;且苯硫脲能强烈抑制体液中酚氧化酶活性,而叠氮化钠对其活性抑制较弱;由此推测文昌鱼体液中酚氧化酶可能是一种酪