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重要海水养殖鱼类MHCⅡ基因克隆、表达及多态性分析

张玉喜  
【摘要】: 主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是脊椎动物中发现的编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群,并且其某些基因型与生物体抗病能力存在一定的关联关系。本研究以我国重要海水经济养殖鱼类真鲷、大菱鲆和牙鲆为实验材料,利用PCR、RT-PCR、RACE、Southern blot等技术研究了MHCⅡ基因的克隆、表达、等位基因的多态性以及等位基因的多态性与鱼体抗病力之间的关系,为筛选抗病相关MHCⅡB基因标记,建立基因标记辅助选育技术提供基础。 (1)根据本实验室建立的真鲷cDNA文库中EST序列测序,得到全长为1191bp的MHCⅡBcDNA序列(Genbank accession NO.: AY848956),经BLAST分析为MHCⅡB基因。和其它脊椎动物的全长基因组序列比较,设计特异性引物进行内含子的PCR扩增,得到2494bp的基因组全序列。以rsbMHC2bIn1N和rsbMHC2bIn4C为引物进行PCR扩增,扩增产物包括完整开放阅读框序列,有7个真鲷个体被用于分析真鲷MHCⅡB的多态性,结果得到6个不同的等位基因。为了研究真鲷MHCⅡB的位点数量,用同一对引物对同一真鲷个体的开放阅读框的cDNA序列进行了PCR扩增。在所测序的11个不同的阳性克隆中,有4个不同的cDNA序列被鉴定出。另外,利用rsbMHC2b3’UTRN和rsbMHC2b3’UTRC为引物,扩增同一真鲷个体的3’UTR,有12个阳性克隆被测序,测序结果中有2个不同的序列被鉴定出,表明MHCⅡB基因至少存在两种不同的位点。用Southern blot方法进一步验证真鲷MHCⅡB基因的位点数。用MEGA3.0构建系统进化树,结果发现真鲷MHCⅡB基因的7种不同的序列聚类到一簇,另外与鲈鱼的亲缘关系较近,与丽鱼、虹鳟、大西洋鲑的亲缘关系次之,与小鼠和人类的最远。以正常鱼和鳗弧菌感染后真鲷组织为材料,以反转录合成的第一链cDNA为模板,应用RT-PCR半定量检测方法对真鲷的MHCⅡB基因组织表达特点进行了研究,结果表明,在正常真鲷组织中,其中较强的表达于鳃、脾、头肾、肾、胃、小肠和心脏中,在肌肉和血中表达最弱。在鳗弧菌感染后的肝脏、脾脏、小肠和头肾组织中,卡方检验表明,MHCⅡB基因表现为具有极显著差异的表达(χ2=103.79,248.19,19.44和87.38,P0.01)。


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