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《中国海洋大学》 2006年
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牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的研制及应用

程顺峰  
【摘要】: 淋巴囊肿病(Lymphocystis disease LCD)是一种世界范围流行的鱼类病毒病,病原是淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV)。患病鱼的主要症状是体表长有皮肤瘤状和菜花状的赘生物,丧失商品价值。自1997年在威海地区养殖的牙鲆中首次发生以来,该病迅速蔓延至浙江、辽宁、河北等省沿海地区。近年来该病一直在养殖牙鲆中流行,给水产养殖业造成的经济损失高达数百亿元之巨。 本论文对淋巴囊肿病毒纯化方法、病毒结构蛋白及其抗原性、单克隆抗体的制备、病毒培养及其感染牙鲆鳃细胞的动态变化进行了研究,取得了以下结果:优化了病毒的提纯方法并使之程序化;判定病毒结构蛋白带共有22条,且三条蛋白带具有抗原性;制备了单克隆抗体,并应用多种免疫学方法证实了单抗针对病毒的特异性,确认了五个蛋白为病毒的衣壳蛋白,并且在这五个蛋白多肽上具有线形抗原决定簇;发现病毒感染鳃细胞后24小时之内,开始复制,48-72小时达到顶峰。 优化的LCDV病毒提纯的方法为:首先剥离囊肿组织表面的薄膜,然后采用多次匀浆处理肿瘤组织,尔后将组织匀浆液于650×g和1 800×g分别离心20 min,将离心获得的上清液配成30%(W/W)蔗糖溶液,4℃条件下进行78, 500×g,180 min超速离心,病毒沉淀用TNE缓冲液重悬后进行蔗糖密度梯度离心即可。纯化的LCDV病毒负染后,电镜观察发现其呈近似于圆形的多角形,结构完整。LCDV病毒经SDS-PAGE,硝酸银染色,电泳图谱清晰显示其结构蛋白共有22条,且分子量主要集中在123-26 kDa之间。应用兔抗LCDV血清分析结构蛋白的抗原性,结果显示分子量为123.55、65.292和54.438 kDa的3条蛋白带发生了免疫反应,其中分子量为65.292 kDa的蛋白带反应强度明显高于其它2条蛋白带。 以纯化的LCDV为抗原免疫Balb/C小鼠,采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选、有限稀释法克隆共获得了13株单克隆抗体(1A8、1D7、2B6、2F6、2D11、2G6、3A5、3G3、3D6、3G12、4C8、4D9、4B6)。ELISA初步筛选结果显示,这13株杂交瘤细胞分泌的抗体的吸光值相对于其他阳性杂交瘤细胞的较高,免
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S943

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 许国晶;牙鲆免疫应答的温度效应及黏膜免疫分子的研究[D];中国海洋大学;2012年
2 汪沐;牙鲆淋巴囊肿病毒细胞受体的鉴定与特性分析[D];中国海洋大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 吴成龙;大菱鲆红体病虹彩病毒的流行情况调查及其主要衣壳蛋白在毕赤酵母中的重组表达[D];中国海洋大学;2007年
2 杜程鹏;淋巴囊肿病毒受体蛋白在牙鲆组织中的分布及其黏附蛋白研究[D];中国海洋大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐洪涛,朴春爱,姜忠良,王文兴;养殖牙鲆淋巴囊肿病病原的研究[J];病毒学报;2000年03期
2 庄向生,周伦江,王长兵,刘玉涛,程由铨,林天龙,林梅,刘健宏;传染性法氏囊病毒中和单抗初步应用研究[J];福建农业学报;2001年04期
3 曲凌云,孙修勤,战文斌,张进兴;牙鲆抗淋巴囊肿病毒免疫球蛋白的纯化[J];高技术通讯;2000年09期
4 孙修勤,曲凌云,张进兴;牙鲆淋巴囊肿病毒的病原性与免疫原性[J];高技术通讯;2000年09期
5 战文斌,张利峰,张志栋,周丽,宋微波;中国对虾血细胞单克隆抗体研制及对虾血细胞类型的鉴别[J];高技术通讯;2001年06期
6 刘允坤,孙修勤,黄捷;牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊肿病毒的分离[J];高技术通讯;2002年06期
7 刘允坤,孙修勤,黄捷,张进兴;牙鲆淋巴囊肿病的PCR诊断方法研究[J];高技术通讯;2002年11期
8 孙修勤,洪旭光,张进兴,张士璀,汪敏,童尚亮;牙鲆淋巴囊肿病毒在牙鲆鳃细胞系FG-9307中的增殖[J];高技术通讯;2002年12期
9 吴兴安,胡刚,李继业,刘勇,张芳琳,于澜,白文涛,孙修勤,徐志凯;淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白基因片段原核载体的构建及表达[J];高技术通讯;2003年06期
10 曲凌云,张进兴,孙修勤;养殖牙鲆淋巴囊肿病流行状况与组织病理学研究[J];黄渤海海洋;1999年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐洪涛,朴春爱,姜忠良,王文兴;养殖牙鲆淋巴囊肿病病原的研究[J];病毒学报;2000年03期
2 张奇亚;水生低等脊椎动物病毒生态学研究[J];病毒学报;2001年03期
3 张奇亚,肖枫,李正秋,桂建芳;从我国分离的3株蛙虹彩病毒与蛙病毒3型主要衣壳蛋白基因同源性的比较[J];病毒学报;2001年04期
4 张奇亚,肖枫,李正秋,桂建芳;从我国分离的3株蛙虹彩病毒与FV3主要衣壳蛋白基因同源性的比较[J];病毒学报;2002年01期
5 付小哲;石存斌;李宁求;潘厚军;常藕琴;吴淑勤;;军曹鱼淋巴囊肿病毒主衣壳蛋白基因全序列分析[J];病毒学报;2007年05期
6 李华;孙志鹏;李强;江育林;;条石鲷检出的虹彩病毒特性研究[J];病毒学报;2011年02期
7 江育林;张旻;景宏丽;高隆英;;患病中国大鲵中分离到一株虹彩病毒及其特性的研究[J];病毒学报;2011年03期
8 刘卫东,苏浩,邓立康;微生物在水产养殖中的应用[J];水产科学;2001年02期
9 郭建东,唐金宝,祝茜,吉爱国,孟凡信;水产养殖病原微生物的分子检测[J];水产科学;2005年01期
10 李光;樊景凤;林凤翱;梁玉波;;对虾的免疫机制及其疾病免疫预防的研究进展[J];水产科学;2007年01期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 许道艳;刘仁沿;李伟;梁玉波;;酶联免疫吸附法分析失去记忆性贝毒ASP[A];有毒化学污染物监测与风险管理技术交流研讨会论文集[C];2008年
2 林学政;王能飞;陈靠山;赵爱云;;中国外来海洋生物种类及其生态影响[A];中国海洋学会海洋生物工程专业委员会2005年学术年会论文集[C];2005年
3 黄美珍;李志棠;;海洋生物技术在水产养殖生物病害防治中的应用[A];第二届全国海珍品养殖研讨会论文集[C];2000年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张彦娇;盐度和温度对大菱鲆非特异性免疫力的影响及淡水螯虾相关免疫因子的研究[D];中国海洋大学;2010年
2 李永芹;养殖鱼类病原菌检测芯片技术的建立[D];中国海洋大学;2010年
3 孙爱;大黄鱼(Pseudosciaena crocea)三种组织细胞系的建立、鉴定及其应用的初步研究[D];中国海洋大学;2010年
4 徐晓丽;对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用[D];中国海洋大学;2011年
5 马璀艳;TNP-LPS和TNP-KLH诱导的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)抗体分泌细胞的分化研究[D];中国海洋大学;2011年
6 刘云;牙鲆免疫系统形态结构、发育和感染病理反应的研究[D];中国海洋大学;2003年
7 管越强;主要环境因子对养殖对虾抗病力及白斑综合症发生的影响[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2003年
8 乌日琴;牙鲆鲆淋巴细胞的免疫反应动力学研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2003年
9 章跃陵;南美白对虾类Ig的定性、功能和免疫分子进化的研究[D];厦门大学;2003年
10 史成银;我国养殖大菱鲆病毒性红体病的研究[D];中国海洋大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘宏;流行性造血器官坏死病毒ELISA检测方法的初步建立[D];华中农业大学;2010年
2 徐晓辉;两种星鲽组织细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
3 李文峰;大菱鲆(Scophthalmus maximus)体细胞培养及其在病毒研究中的应用[D];中国海洋大学;2010年
4 王希龙;多种鱼类血清Ig广谱型单克隆抗体的筛选与分析[D];福建师范大学;2010年
5 李玖营;三氟氯氰菊酯的风险评估及其检测体系研究[D];吉林农业大学;2011年
6 牟为;基于体内诱导表达系统在迟钝爱德华氏菌中构建多价载体疫苗[D];华东理工大学;2011年
7 宋佳蕾;鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)胶体金免疫层析试纸条的研制[D];中国海洋大学;2011年
8 袁玉仁;野生和养殖花鲈消化酶活性比较及碱度对花鲈幼鱼消化酶活性的影响[D];中国海洋大学;2011年
9 赵娜;海豚链球菌(Strepstococcus iniae)胞外产物的特性及其对牙鲆的免疫效应[D];中国海洋大学;2011年
10 王晴;哈维氏弧菌外膜蛋白基因ompU的克隆表达、DNA疫苗构建及对大菱鲆免疫效果探究[D];中国海洋大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郭爱珍,陆承平;犬瘟热病毒细胞膜受体的鉴定[J];病毒学报;2000年02期
2 邓敏,何建国,左涛,翁少萍,曾慷,吕玲,周松裕,龙綮新;鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)PCR检测方法的建立及虹彩病毒新证据[J];病毒学报;2000年04期
3 邓敏,何建国,翁少萍,曾征,龙綮新;鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因组文库和物理图谱的建立[J];病毒学报;2001年03期
4 何华虹,邓敏,何建国,翁少萍;鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的胞嘧啶5-甲基转移酶基因结构及其序列分析[J];病毒学报;2001年04期
5 杨先乐,左文功;水温与草鱼免疫应答关系的研究[J];动物学报;1997年01期
6 孙战胜,陈劲春;重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制[J];北京化工大学学报(自然科学版);2004年04期
7 袁新清,陈劲春;人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达[J];北京化工大学学报(自然科学版);2004年06期
8 仲燕,刘军华,张建鹏,冯伟华,焦炳华;东海贻贝抗菌肽Myticin A基因的克隆表达及其生物学活性[J];第二军医大学学报;2005年01期
9 郑昕,王运吉;贻贝粘合蛋白基因转化巴斯德毕赤酵母[J];大连轻工业学院学报;2003年02期
10 巩华;吴淑勤;潘厚军;;硬骨鱼类黏膜免疫机理研究概况[J];动物医学进展;2006年06期
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 唐小千;中国对虾白斑症病毒(WSSV)血细胞受体蛋白的研究[D];中国海洋大学;2010年
2 徐晓丽;对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用[D];中国海洋大学;2011年
3 张志栋;用对虾血细胞单克隆抗体研究分析白斑症病毒的受体[D];中国海洋大学;2005年
4 李强;牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的研制及其在牙鲆淋巴囊肿病研究中的应用[D];中国海洋大学;2007年
5 冯守明;大菱鲆粘膜及淋巴细胞对迟缓爱德华氏菌免疫应答的研究[D];中国海洋大学;2008年
6 刁菁;牙鲆淋巴囊肿病毒黏附蛋白及受体蛋白的研究[D];中国海洋大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 宋佳蕾;鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)胶体金免疫层析试纸条的研制[D];中国海洋大学;2011年
2 王向东;对虾白斑综合症病毒(WSSV)细胞膜受体及高分子量蛋白的初步研究[D];中国海洋大学;2004年
3 陆春玲;对虾白斑综合症病毒受体阻断剂的初步筛选[D];中国海洋大学;2004年
4 罗展;重组表达的基因改造粘附蛋白(rVAP1)对白斑综合征病毒(WSSV)感染的阻断作用[D];中国海洋大学;2006年
5 王辉;斑马鱼多聚免疫球蛋白受体(zplgR)基因的克隆[D];山东师范大学;2007年
6 张春刚;乳中IgA和IgM含量的变化及其影响因素的机理研究[D];扬州大学;2008年
7 周优;IHHNV和LCDV实时定量PCR检测方法的建立与应用[D];中国海洋大学;2008年
8 邵蓬;牙鲆感染淋巴囊肿病毒后靶器官定位及抗体水平检测[D];中国海洋大学;2008年
9 王磊;鲤鱼多聚免疫球蛋白受体(cplgR)功能的研究[D];山东师范大学;2009年
10 杨凡;中国鲽形目鱼类的DNA分子条形码及褐牙鲆的遗传多样性研究[D];暨南大学;2010年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 丁冰洁;绳秀珍;唐小千;邢婧;战文斌;;大菱鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆及表达分析[J];中国水产科学;2013年04期
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 丁冰洁;大菱鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆及表达研究[D];中国海洋大学;2013年
2 陈孔茂;大菱鲆免疫球蛋白D重链基因的克隆与表达研究[D];中国海洋大学;2013年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 程由铨,李怡英,林天龙,黄宁,郑琦,宋铁英,吴平;新城疫病毒单克隆抗体的特性及应用[J];病毒学报;1987年04期
2 顾方舟,沐桂藩,吕华,徐如良;柯萨奇病毒的细胞受体单克隆抗体的制备与鉴定[J];病毒学报;1988年01期
3 邵健忠,项黎新,毛树坚,沈志荣;三角帆蚌瘟病病毒的精细结构与基因组及多肽的研究[J];病毒学报;1993年02期
4 张奇亚;水生低等脊椎动物病毒生态学研究[J];病毒学报;2001年03期
5 何华虹,邓敏,何建国,翁少萍;鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的胞嘧啶5-甲基转移酶基因结构及其序列分析[J];病毒学报;2001年04期
6 张奇亚,肖枫,李正秋,桂建芳;从我国分离的3株蛙虹彩病毒与蛙病毒3型主要衣壳蛋白基因同源性的比较[J];病毒学报;2001年04期
7 彭宝珍,任家鸣,沈菊英,周国瑛,顾惠庭,沈亚林,郑国兴,龚祖埙;急性致死性对虾病的杆状病毒病原研究[J];病毒学报;1995年02期
8 陈细法,吴定虎,黄槐,陈平,池信才;对虾病毒病病毒和细菌合并感染的病理特点和诊断价值[J];病毒学报;1997年02期
9 邵健忠,钱凯先,项黎新,李亚南,毛树坚;病毒诱导草鱼产生干扰素活性因子的研究[J];病毒学报;1998年04期
10 王铁辉,张义兵,李戈强,易泳兰,刘汉勤,朱作言;鱼类培养细胞干扰素的诱导[J];病毒学报;1999年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;鱼类淋巴囊肿病毒中国株基因组破译完成[J];饲料工业;2004年12期
2 许杰;养殖牙鲆淋巴囊肿病及防治[J];河北渔业;2005年04期
3 贾晓刚;;鱼类的淋巴囊肿病[J];齐鲁渔业;2009年12期
4 刘允坤,孙修勤,黄捷;牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊肿病毒的分离[J];高技术通讯;2002年06期
5 肖国华;王玉梅;赵振良;张立坤;刘丽杰;赵海涛;高晓田;;牙鲆淋巴囊肿病毒灭活疫苗制备及应用[J];河北渔业;2008年07期
6 肖国华;张发东;朱清杰;刘丽杰;张立坤;赵海涛;高晓田;;牙鲆淋巴囊肿病药物防治试验[J];河北渔业;2008年06期
7 汪岷;马广勇;;鱼淋巴囊肿病毒研究进展[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2006年05期
8 吕宏旭,汪岷,李红岩,郭华荣,张士璀,包振民,周丽;利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒[J];青岛海洋大学学报(自然科学版);2003年02期
9 程顺峰;战文斌;绳秀珍;;淋巴囊肿病毒结构蛋白及其抗原性分析[J];中国水产科学;2006年03期
10 程顺峰;;鱼类淋巴囊肿病毒感染牙鲆鳃细胞系的研究[J];中国农学通报;2009年18期
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 亦云;基础科学研究推动健康养殖发展[N];中国渔业报;2009年
2 厦门市同安银祥实业有限公司 陈振禄 王纬纬;海水网箱养殖技术及疾病防治[N];中国海洋报;2001年
3 赵建东;外来海洋生物入侵令人忧[N];中国渔业报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前7条
1 王越;鱼类淋巴囊肿病毒核酸检测诊断技术的研究[D];中国海洋大学;2005年
2 汪沐;牙鲆淋巴囊肿病毒细胞受体的鉴定与特性分析[D];中国海洋大学;2012年
3 邢明青;牙鲆淋巴囊肿病自愈机制的研究[D];中国海洋大学;2008年
4 程顺峰;牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的研制及应用[D];中国海洋大学;2006年
5 徐晓丽;对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用[D];中国海洋大学;2011年
6 孙颖杰;牙鲆弹状病毒的鉴定和检测方法研究及应用[D];吉林大学;2010年
7 郑媛;半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)细胞培养及细胞系建立研究[D];中国海洋大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杜程鹏;淋巴囊肿病毒受体蛋白在牙鲆组织中的分布及其黏附蛋白研究[D];中国海洋大学;2012年
2 徐宋娟;鱼类淋巴囊肿病毒的免疫检测技术研究[D];中国海洋大学;2005年
3 邵蓬;牙鲆感染淋巴囊肿病毒后靶器官定位及抗体水平检测[D];中国海洋大学;2008年
4 马广勇;牙鲆淋巴囊肿病毒在牙鲆鳃细胞系(FG)中的增殖以及在鱼体中组织嗜亲性研究[D];中国海洋大学;2006年
5 乔迁;大菱鲆红体病虹彩病毒核酸疫苗及两种海水名贵鱼类疾病的研究[D];中国海洋大学;2010年
6 宋佳蕾;鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)胶体金免疫层析试纸条的研制[D];中国海洋大学;2011年
7 娄慧敏;褐牙鲆干扰素调节因子5(IRF-5)的克隆与表达分析[D];中国海洋大学;2012年
8 王庚申;养殖许氏平鲉两种细菌性病原的分离、鉴定及组织病理学研究[D];上海海洋大学;2012年
9 廖倩;两种虹彩病毒模拟表位的生物信息学筛选与生物淘筛及原核表达载体的构建[D];国家海洋局第一海洋研究所;2012年
10 原媛;大菱鲆红体病的病原检测研究[D];中国海洋大学;2013年
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