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组织工程人工角膜内皮载体膜片的制备、性质及对角膜内皮损伤修复的实验研究

陈列欢  
【摘要】: 甲壳素广泛存在于低等动物,特别是节肢动物的外壳、真菌及一些藻类细胞的细胞壁中,是一种天然的生物高分子多糖。甲壳素经过脱乙酰基反应成为壳聚糖,它是一种天然聚阳离子功能性生物多糖,具有优良的生物相容性,在体内可降解成为机体所需的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖,在生物医用材料和组织工程方面得到较广泛研究和应用。 角膜内皮细胞是位于角膜后部的单层细胞,前面与后弹力层相连,后面与房水相接触。角膜内皮细胞在维持正常角膜脱水状态、角膜厚度、透明度方面起着关键作用。目前,穿透性角膜移植术是取代病变或受损的内皮细胞恢复角膜透明性的唯一方法。但是供体来源的短缺、老年化及术后免疫排斥反应的发生,直接影响着角膜移植手术的开展和成败。组织工程学是一门以细胞生物学和材料学相结合,进行体外或体内构建组织或器官的新兴科学,利用组织工程方法体外构建人工角膜内皮是解决角膜内皮盲的有潜力的途径,而供内皮细胞生长的体外载体的研究成为组织工程角膜内皮研究的关键。目前供内皮细胞生长的体外载体报道最多的是同种异体或异种角膜的后弹力层(DM),由于后弹力层上有层粘连蛋白(LN)存在,而层粘连蛋白(LN)在内皮细胞贴壁的过程中起着重要作用,因此后弹力层是内皮细胞的最佳底物。除了DM外,报道的载体尚有可生物降解的聚合物PLLA和PLGA、水凝胶膜、胶原膜、明胶薄膜以及羊膜等。但上述载体各有缺点,距离临床有较大距离,而且没有以多糖为主要材料的角膜内皮载体见到报道。本实验选择甲壳素及其衍生物为基本材料,通过与其他多糖的共混,制备出适合角膜内皮细胞生长的膜片,以期解决角膜内皮缺损的问题。 本实验取得以下几个方面成果和进展: 1、系统的研究了甲壳素、壳聚糖原料和不同脱乙酰度壳聚糖和产物的性质。研究了甲壳素、壳聚糖及其羧甲基衍生物的纯化方法,制备出符合体内应用的高纯度,无菌无热原医用材料。对壳聚糖的脱乙酰度与生物相容性和生物降解性之间的关系进行了初步研究,结果发现脱乙酰度越高降解速度越慢,而高脱酰度的壳聚糖生物相容性与低脱乙酰度的类似,但炎症反应发生的时机要晚一些,这与其炎症反应的机制有关。对羧甲基壳聚糖和羧甲基甲壳素的生物相容性进行了初步评价,MTT法测试不同浓度的材料对L929小鼠成纤维细胞相对增值率的影响,结果证明两种原料的毒性分级为0级,属于无毒性材料。 2、制备出壳聚糖-硫酸软骨素(Ch-Cs)、壳聚糖-羧甲基壳聚糖(Ch-Cm)、壳聚糖-透明质酸(Ch-Ha)三种共混膜,研究了三种共混膜的透光性、亲水性、通透性、机械性能、表面结构、蛋白吸附能力、红外图谱以及生物相容性和生物降解性。结果表明三种共混膜都具有良好的透明性、亲水性和机械性能以及粗糙的表面结构,并且对蛋白有较好的吸附能力,但三种共混膜之间略有差异。综合对比三种共混膜,筛选出Ch-Cs物理化学性质最为合适。研究了兔角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞的原代和传代培养技术,研究了猫角膜内皮细胞的原代和传代培养技术,能体外获得大量高纯度的角膜细胞。以不同类型的壳聚糖共混膜为支架进行体外培养角膜基质细胞、上皮细胞和内皮细胞实验研究。观察兔角膜基质细胞、上皮细胞和内皮细胞在不同共混膜上的生长情况,研究不同类型共混膜与角膜细胞的生物相容性,结果说明三种共混膜片与角膜上皮和基质细胞都具有较好的生物相容性,而Ch-Cs共混膜最适合角膜内皮细胞生长,被确定为本研究的角膜内皮载体材料。 3、从体外酶解-体内肌肉植入-眼角膜基质层间植入三个层面评价了Ch-Cs共混膜的生物降解性和生物相容性,各实验结果表现出相同的特点:共混膜片能够逐步降解,肌肉植入和层间植入显示其具有良好的生物相容性和降解性。其中,溶菌酶降解实验证明共混膜能够在21天内被降解成碎片,而大鼠肌肉植入实验说明共混膜能够在60天内基本被降解吸收,组织反应比较温和。植入到猫角膜内的膜片在观察期内完全没有炎症反应,没有免疫排斥,动物角膜长时间保持透明,在植入第35天时膜片基本被吸收,该结果在同类实验中表现最好。 4、首次对水溶性致孔剂进行了大量的筛选,包括麦芽糖、脲、柠檬酸、硫酸镁、硫酸铵、硫酸钾、醋酸钠、氯化镁、醋酸钾等多种化合物。通过光镜、电镜观察和通透性实验证明醋酸钾在对膜片表面结构和通透性改进方面具有较好的效果。实验结果表明,经不同醋酸钾致孔的Ch-Cs共混膜片的通透性都优于截留分子量为8000道尔顿的醋酸纤维素透析袋膜片,其中醋酸钾致孔剂质量为膜片固形物两倍时的膜片通透性最好,并且有着合适的表面结构。利用研制的两种特定曲率多糖膜片制膜设备,制备出特定曲率的、透明性和机械性能良好并且适合角膜内皮细胞贴附与生长的曲率膜片。 5、以曲率膜片为载体,分别进行了兔、猫组织工程角膜内皮支架的构建,在曲率Ch-Cs共混膜上成功的培养了兔角膜内皮细胞和猫角膜内皮细胞,构建出组织工程化角膜内皮,细胞培养实验结果标表明:与培养板对照相比,Ch-Cs共混膜更适合角膜内皮细胞的贴附与生长,并且贴附牢固。进一步进行了新西兰兔和猫角膜内皮缺损动物模型的修复试验研究,结果表明角膜缺损模型新西兰兔的角膜短期(30天)透明率为80%,长期(250天)透明率为46%,表明植入的组织工程化角膜内皮对角膜缺损具有一定的修复作用。


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