收藏本站
《中国海洋大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

海洋细菌褐藻胶裂解酶在大肠杆菌中表达,加工与转运及重组酶的纯化与性质研究

马丽艳  
【摘要】: 随着海洋资源的开发与利用,海洋药物也蓬勃发展,具有多种生物活性和生理功能的褐藻胶受到人们的重视。褐藻胶经降解获得的寡糖能显著提高生物活性并赋予新的生物活性,用微生物褐藻胶裂解酶裂解褐藻胶是获得具有生理功能褐藻寡糖更好的方法。 假交替单胞菌(Pseudoalteromonas elyakovii IAM 14594)产的褐藻胶裂解酶(AlyPEEC)具有较宽的底物特异性,能够裂解褐藻胶的各种组成嵌段,并可能是Laminaria褐斑病的毒力因子。该酶全基因ORF编码398个氨基酸的前体蛋白,包含有三个结构域:信号肽、N-端的前体肽和成熟蛋白区域。此酶在细胞质中合成后分泌,分泌过程中切除信号肽和前体肽形成成熟蛋白,成熟蛋白分子量为32 kDa,分泌到细胞外。 为了大量制备该褐藻胶裂解酶用以生产褐藻寡糖,我们首先要研究AlyPEEC在大肠杆菌中表达和加工情况。为了研究需要,本文首先从原始菌株中纯化褐藻裂解酶,用以免疫小鼠制备抗褐藻胶裂解酶多克隆抗体。经间接ELISA方法检测抗体效价为1/128,可以完全特异性地识别褐藻胶裂解酶。 本研究成功地将alyPEEC基因及编码成熟蛋白区域的基因序列克隆到阿拉伯糖诱导表达载体pBAD24上,构建重组表达质粒pBAD-ALY和pBAD-csALY,在大肠杆菌TOP10中通过阿拉伯糖诱导表达,结果表明TOP10/pBAD-csALY在诱导表达后没有褐藻胶裂解酶活性,TOP10/pBAD-ALY诱导后表达,且具有活性,酶表达量是原始菌株的7.5倍,并且海水影响其蛋白表达及其活性,添加海水比淡水培养基活性高5.8倍。海水影响活性重组褐藻胶裂解酶的产量,海水的组分MgCl2、NaCl、CaSO4能够提高活性酶的产量。RT-PCR方法检测,海水不影响褐藻胶裂解酶基因的mRNA表达水平,含50%(v/v)海水和不含海水的LB培养基中,褐藻胶裂解酶基因的mRNA表达水平相等。Western bloting方法检测蛋白表达,经凝胶成像系统软件分析表明培养基中添加海水能够促进重组蛋白的表达或者增强蛋白质的稳定性。海水在前体蛋白加工上有重要的影响,添加海水能够促使蛋白前体加工成有活性的成熟蛋白。另外表达的重组蛋白分泌到细胞周质空间及细胞外环境中,而不形成包涵体,从而避免蛋白复性等许多问题。 将重组表达载体pBAD-ALY转入大肠杆菌MC4100A(wt)CU164A(SecY缺陷型)和BILKOA(Tat缺陷型)中,通过诱导表达AlyPEEC,研究蛋白的转运与加工过程。研究发现,AlyPEEC在大肠杆菌中通过Sec途径转运,转运到细胞周质和培养基中,在细胞周质中的存在两种分子量的活性蛋白分别是42 kDa和32 kDa。细胞质中仍然存在成熟蛋白,这可能是在跨膜时,蛋白没有完全转运。 通过分子筛Sephadex G-75柱和离子交换层析DEAE-Sepharose Fast Flow两步法纯化重组酶。纯化的重组褐藻胶裂解酶最适温度为30℃,是一个热不稳定酶,在30°C时保温10 min后,仍保留80%的相对酶活,而在70°C保温10 min后完全没有酶活。该重组酶最适pH值为7.0,在pH 6.0 ~ pH 7.0之间重组的褐藻胶裂解酶比较稳定,在低于pH 6.0或高于pH 7.0酶活明显下降。Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Ca2+和Ba2+是重组褐藻胶裂解酶激活剂,而Zn2+, Ag+和Co2+起到抑制作用。螯合剂EDTA较强地抑制重组褐藻胶裂解酶活性,而螯合剂EGTA和1-10-phenanthroline较温和地抑制重组褐藻胶裂解酶活性,这说明纯化的褐藻胶裂解酶是金属酶(Ramirez-Zavala et al. 2004)。PMSF也微弱地抑制重组褐藻胶裂解酶活性,这说明丝氨酸残基对褐藻胶裂解酶的活性中心是必要的(George and Diwan 1983)。该重组褐藻胶裂解酶能够裂解海藻酸钠、poly M、poly G,具有较宽的底物特异性。裂解产物为四糖到六糖的寡聚糖。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

手机知网App
【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 李建伟;海洋细菌Pseudoalteromonas sp.SM0524分泌的褐藻酸裂解酶的研究[D];山东大学;2011年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郭忠武,王来曦;糖化学研究进展[J];化学进展;1995年01期
2 孙丽萍,薛长湖,许家超,李兆杰,蔡跃飘,赵雪;褐藻胶寡糖体外清除自由基活性的研究[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2005年05期
3 孙燕,吕志华,王远红,张真庆;酶解褐藻胶寡糖的HPCE分析方法研究[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2005年06期
4 李志军,贾效伟,吕照龙;褐藻保健活性成分的研究现状[J];山东食品科技;2003年08期
5 朱仁华;三种海螺解壁酶组分的比较研究——Ⅲ.其他糖酶[J];海洋学报(中文版);1983年05期
6 童芹,杨运桂,张惠堂,陈燕,杨胜利,龚毅;硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主促进含半胱氨酸残基的重组蛋白可溶性表达[J];生物化学与生物物理学报;2001年01期
7 张伟;刘志敏;陈惠鹏;;酵母蛋白分泌途径的研究进展[J];生物技术通讯;2006年01期
8 杨喆,李太华,徐维明;大肠杆菌中外源基因表达的研究进展[J];微生物学免疫学进展;2000年02期
9 张香治,薛长湖,许萍,赵雪,张永勤;利用Pseudoalteromonas elyakouii菌株发酵法生产褐藻胶寡糖培养基的改进[J];食品与生物技术学报;2005年05期
10 李满,马贤凯;核糖体结合位点序列对大肠杆菌中HBcAg重组质粒表达的影响[J];遗传学报;1992年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 游银伟,汪天虹,岳寿松;海洋青霉(Penicilliumsp.)FS010441的形态学观察和产纤维素酶性质初步研究[J];山东农业科学;2005年01期
2 李瑞国;朱秀敏;杨慧;;不同萌发期绿豆芽蛋白质含量的测定及营养价值分析[J];山东农业科学;2011年01期
3 葛宏华,孙莉宁,张其瑞;家蚕血淋巴蛋白的发育变化和BmLSP的纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);2001年03期
4 孔小卫,李坤,江洪波;二甲亚砜对水稻浸种及苗期的后续效应研究[J];安徽大学学报(自然科学版);2002年03期
5 刘晓颖,丁毅;鸡脑P物质的制取及分析[J];安徽大学学报(自然科学版);2003年01期
6 朱华庆,陈飞,谢惠安,张萍;热击对水稻(O.sativaL.)叶绿素a,b及POR同功酶的效应[J];安徽大学学报(自然科学版);1998年04期
7 叶生梅;多菌联合固态发酵生产酒糟菌体蛋白饲料的实验研究[J];安徽机电学院学报;2001年04期
8 孔小卫;二甲亚砜(DMSO)对大豆萌发及幼苗期生理生化指标的影响[J];安徽机电学院学报;2002年04期
9 叶生梅,王岚岚,欧阳明;一株纤维素酶产生菌的固态发酵初步研究[J];安徽工程科技学院学报(自然科学版);2003年01期
10 刘辉;张庆庆;危勤涛;舒伟刚;;红曲霉发酵米酒工艺条件的研究[J];安徽工程科技学院学报(自然科学版);2009年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 周亚军;康建波;刘妍菊;苏丹;马龙彪;;混合肉肌原纤维蛋白特性研究[A];管产学研助推食品安全重庆高峰论坛——2011年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨全国食品科学与工程博士生学术论坛论文集[C];2011年
2 龚加顺;胡小静;彭春秀;周红杰;;普洱茶及其原料多糖分子组成及光谱学特性研究[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第二卷)[C];2010年
3 刘四光;李文权;郑啸;邓永智;蔡明刚;梁燕茹;;自养小球藻(Chlorella autotropica)多糖提取纯化方法研究[A];中国海洋学会海洋生物工程2005年学术年会论文集[C];2005年
4 刘四光;李文权;郑啸;邓永智;蔡明刚;梁燕茹;;自养小球藻(Chlorella autotropica)多糖提取纯化方法研究[A];中国海洋学会海洋生物工程专业委员会2005年学术年会论文集[C];2005年
5 杨小亮;李瑞珍;徐碧玉;金志强;;香蕉1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶反义基因转化香蕉的研究[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
6 白瑞霞;张媛;彭建营;;植物细胞工程技术在枣育种中的应用[A];第五届全国干果生产、科研进展学术研讨会论文集[C];2007年
7 李强;陈明;夏蕊蕊;张玉臻;;生物絮凝剂产生菌M-503的分离鉴定及絮凝特性研究[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
8 付加雷;宋长征;张更林;;壳聚糖/海藻酸钠微囊对干扰素-tau的控释作用[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年
9 任慧霞;赵雪;聂晓燕;;健脾止遗片有效成分对家兔膀胱明胶酶的影响[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年
10 邹莹;;硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的提取[A];第十二届山东省药剂学术会议论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张在红;两种天然抗菌糖缀合物及衍生物的合成[D];中国海洋大学;2010年
2 徐军;富苯丙氨酸碱性短肽的发现及其对蛋白质等电点和免疫交叉反应的影响[D];华南理工大学;2010年
3 汤海青;用海洋细菌Pseudoalteromonas tetrodonis QZ-4发酵生产褐藻胶裂解酶的研究[D];浙江大学;2010年
4 陈义勇;桦褐孔菌多糖纯化、结构及其抗肿瘤机制研究[D];江南大学;2010年
5 田壮;食品中甾体激素残留免疫分析技术与方法研究[D];江南大学;2010年
6 邵凌健;槐糖脂补料发酵及抗真菌、抗肿瘤活性的研究[D];山东大学;2010年
7 迟雷;基于过程控制优化的重组大肠杆菌高密度发酵研究[D];西北大学;2011年
8 聂永心;黄伞子实体多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性的研究[D];山东农业大学;2011年
9 孙红男;苹果渣中多酚类物质的高压脉冲电场处理及其生物活性研究[D];北京林业大学;2011年
10 冯敏毅;壬基酚对雄性花背蟾蜍抱对、精子及早期发育的影响[D];兰州大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 周艳华;可溶性鸡蛋壳膜蛋白与多肽的制备及其抗氧化活性的研究[D];华中农业大学;2010年
2 冷一非;嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育、培养及冻干发酵剂的研究[D];华中农业大学;2010年
3 申君;桃蚜的抗药性监测、杀虫剂的配方筛选及其增效生化机理的研究[D];华中农业大学;2010年
4 杜学敏;蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分组分的性质[D];河北大学;2007年
5 刘辉;红曲霉发酵提高γ-氨基丁酸含量的研究[D];安徽工程大学;2010年
6 洪伟;酪蛋白中血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的研究[D];安徽工程大学;2010年
7 王美花;里氏木霉swollenin在米曲霉中的表达和纯化[D];浙江理工大学;2010年
8 徐榕;自由人槭(Acer×freemanii)组培快繁技术体系的构建[D];山东农业大学;2010年
9 张袁;温特曲霉PZ322产岩藻多糖酶的液态发酵条件研究[D];安徽农业大学;2010年
10 王丽丽;珍稀树种乳源木莲和红花木莲引种试验研究[D];安徽农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 吴永沛,何碧烟;九孔鲍褐藻酸酶、琼脂酶及纤维素酶的提取纯化[J];海洋科学;2002年03期
2 朱仁华;三种海螺解壁酶组分的比较研究——Ⅱ.海藻结构多糖酶和海藻糖酶[J];海洋学报(中文版);1983年04期
3 韩宝芹,戴继勋,王海;海藻工具酶研究I.褐藻酸降解菌的分离鉴定及其褐藻酸酶形成条件研究[J];海洋学报(中文版);1997年05期
4 马莲菊;卜宁;马纯艳;于翠梅;陈强;;褐藻胶寡糖对豌豆种子萌发和幼苗的某些生理特性的影响[J];植物生理学通讯;2007年06期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 党福全,陈义,郭晴,徐桂芸;寡糖-8-氨基芘-1,3,6-三磺酸衍生物的毛细管电泳-激光诱导荧光分离[J];高等学校化学学报;2000年02期
2 郭忠武,王来曦;糖化学研究进展[J];化学进展;1995年01期
3 王艳玲,唐学玺,杨震;褐藻酸降解菌的产酶条件研究[J];海洋科学;2003年02期
4 张尔贤,俞丽君,肖湘;鼠尾藻多糖清除氧自由基作用的研究——Ⅰ. 对O_2与OH抑制活性的评价[J];中国海洋药物;1995年01期
5 张尔贤,俞丽君;鼠尾藻多糖清除氧自由基作用的研究 Ⅱ UVc鼠尾藻对多糖抗氧化作用的影响[J];中国海洋药物;1997年03期
6 马贤凯,丁广治,石成华,左平,逯好英,卢秀桂,黄翠芬;乙型肝炎病毒核心抗原基因结构对其在大肠杆菌中表达的影响[J];中国科学(B辑 化学 生物学 农学 医学 地学);1987年01期
7 薛长湖,陈磊,李兆杰,辛梅,林洪,于广利;岩藻聚糖硫酸酯体外抗氧化特性的研究[J];青岛海洋大学学报(自然科学版);2000年04期
8 梁平方,袁璟,孟庆敏;褐藻酸钠降解工艺的研究[J];青岛海洋大学学报;1995年S1期
9 李兆杰,薛长湖,陈磊,方昱,林洪;低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯的清除活性氧自由基和体内抗氧化作用[J];水产学报;2001年01期
10 朱仁华;三种海螺解壁酶组分的比较研究——Ⅰ.纤维素酶(C_x,C_1)和果胶酶[J];海洋学报(中文版);1983年03期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 纪明侯;褐藻胶对放射性锶及其他放射性同位素的阻吸作用[J];海洋科学;1977年01期
2 范晓,张燕霞,齐桂兰;稀酸前处理对海带褐藻胶的提取及其质量的影响[J];海洋科学;1986年02期
3 严小军;褐藻胶的生物合成途径与细胞学研究[J];海洋科学;1993年06期
4 严小军;褐藻胶结构的统计学描述及其应用[J];海洋科学;1993年05期
5 欧昌荣,薛长湖,汤海青,徐大伦;微生物发酵-膜分离法制备褐藻胶寡糖及其产物分析[J];微生物学报;2005年02期
6 甘纯玑;甘景镐;;一种用途广泛的食品添加剂——褐藻胶[J];生物化学与生物物理进展;1986年03期
7 隋战鹰;;褐藻胶用途多[J];生命世界;1993年02期
8 包万友,范晓;某些金属离子对褐藻胶膜构体穿透行为研究[J];海洋学报(中文版);1999年03期
9 刘岩,江晓路,管华诗;褐藻胶裂解酶研究进展[J];中国水产科学;2000年04期
10 顾柯楠;关于褐藻胶作为固定化载体的研究[J];海洋科学;1987年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张淑平;方君宜;柳杰;胡佩红;王春华;;褐藻胶降解方法的研究[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
2 黄琼;黄俊明;杨杏芬;蔡玟;黄建康;李志;李宁;徐海滨;;褐藻胶对小鼠脾淋巴细胞Th1/Th2细胞因子谱影响的体内外研究[A];中国毒理学会放射毒理专业委员会第七次、中国毒理学会免疫毒理专业委员会第五次、中国环境诱变剂学会致突专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致畸专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致癌专业委员会第二次全国学术会议论文汇编[C];2008年
3 李陶陶;许加超;付晓婷;高昕;;钙析法和酸析法所产褐藻胶质量比较的研究[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
4 吴久鸿;;海藻中活性成分抗辐射抗突变提高机体免疫功能的研究概况[A];第四届中国新医药博士论坛论文集[C];1999年
5 贺琳;;海藻酸钠生产工艺清洁生产方案探讨[A];山东环境科学学会2005年度优秀论文集[C];2005年
6 季宇彬;汲晨锋;吴涛;;羊栖菜多糖分离纯化及一级结构研究[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年
7 陈德隆;;我国水产加工业现状及展望[A];北京食品学会成立二十周年学术论文集[C];1999年
8 吴建东;于广利;杨波;赵峡;胡艳南;嵇国利;王培培;;萱藻(Scytosiphon lomentarius)多糖的提取及理化性质研究[A];中国药学会全国多糖类药物研究与应用研讨会论文集[C];2008年
9 赵雪;李八方;董诗竹;李芳;;海带多糖抗氧化活性及机理的研究[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
10 管斌;汤海青;王雪鹏;张书利;邱向峰;董书阁;熊三玉;胡文浪;;从红藻中分离筛选出一株琼胶酶产生菌AT-22[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 周建亮 刘会梅 郭悦;胶南成“褐藻胶之都”[N];青岛日报;2010年
2 记者范仲福 朱鹏;大连海洋所净化技术获专利[N];中国技术市场报;2009年
3 ;海洋科技自主创新的一面旗帜[N];科技日报;2005年
4 柴泽;介绍五种排毒蔬菜[N];江苏农业科技报;2007年
5 王亚;海带提取功效成分新技术获发明专利[N];中国食品报;2010年
6 中国WTO/TBT—SPS国家通报咨询中心;WTO/TBT—SPS最新通报[N];中国国门时报;2004年
7 本报记者 刘成通讯员 丁健 祁晓;明月海藻:将海洋产品加工做深做精[N];经济日报;2007年
8 本报记者 宋学春;中国海带之父[N];人民日报海外版;2003年
9 徐铮奎;关税降低海藻出口后市看好[N];医药经济报;2007年
10 本报记者 宋学春;“中国海带之父”曾呈奎[N];人民日报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘鑫;褐藻胶—鱼肉蛋白质复合凝胶体系流变特性及水分状态的研究[D];中国海洋大学;2010年
2 欧昌荣;褐藻胶寡糖的制备、分析及其应用研究[D];中国海洋大学;2003年
3 宋凯;海洋弧菌Vibrio sp. QY101褐藻胶裂解酶的研究[D];中国海洋大学;2004年
4 胡晓珂;褐藻胶裂合酶工程化研究与应用[D];中国海洋大学;2004年
5 邢丽贞;固定化藻类去除污水中氮磷及其机理的研究[D];西安建筑科技大学;2005年
6 赵峡;聚古罗糖醛酸硫酸酯及其寡糖的制备、结构与活性研究[D];中国海洋大学;2007年
7 郭文斌;门多萨假单胞菌NK-01生物合成褐藻寡糖和PHAMCL及其代谢途径改造[D];南开大学;2012年
8 焦广玲;几种大西洋来源海藻多糖及其衍生物抗2型糖尿病活性的比较研究[D];中国海洋大学;2011年
9 薛美兰;褐藻糖胶对小鼠乳腺癌的体内外抑制作用及机制研究[D];青岛大学;2012年
10 陈安进;不同分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯抗血栓活性及机理研究[D];中国海洋大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李陶陶;褐藻胶生产节能减排关键技术点的研究[D];中国海洋大学;2011年
2 孙学超;不同结构褐藻胶及其系列衍生物的制备与活性研究[D];中国海洋大学;2013年
3 石荣莲;重组褐藻胶裂解酶基因工程菌酶液制备及褐藻胶水解条件研究[D];上海海洋大学;2011年
4 代云法;褐藻胶提取的反应—分离耦合工艺研究[D];中国海洋大学;2012年
5 米玲菲;海带胶提取及纯化技术研究[D];福建农林大学;2011年
6 侯丽;海带加工副产物褐藻胶的综合利用[D];大连海洋大学;2014年
7 张青;褐藻胶钙离子交联体系肠溶空心硬胶囊制备技术[D];中国海洋大学;2013年
8 李安雪;褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养与褐藻水解产物的应用研究[D];上海海洋大学;2013年
9 王静;褐藻胶工业废弃残渣的生物乙醇转化工艺关键技术研究[D];中国海洋大学;2012年
10 孙丽萍;锈凹螺褐藻胶裂解酶的酶学特性及褐藻胶寡糖的活性研究[D];中国海洋大学;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026