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DNA电化学传感器的制备及其在转基因植物产品检测中的应用

徐桂云  
【摘要】: 本论文主要用电化学方法研究DNA探针在固体电极表面的固定,并以亚甲基蓝(MB)为杂交指示剂,将制备的DNA电化学生物传感器用于转基因植物产品外源基因的检测。同时研究丁二酮肟双核铜(II)配合物和双(N-羟乙基氨乙基)草酰胺双联吡啶合铜(II)配合物与DNA的相互作用,考察它们作为DNA电化学杂交指示剂的可能性。 (1)石墨粉、固体石蜡和硬脂酸按一定比例混合制得表面富含羧基的碳糊电极,在电极表面组装荷正电的铝离子膜,在硬脂酸铝离子膜上进行DNA探针的固定以及与目标基因的杂交,并以MB为指示剂检测固定和杂交的效果。用循环伏安法优化了DNA的固定和杂交条件。该电化学生物传感器被成功地用于对转基因大豆的CP4 epsps基因PCR扩增产物的检测,并对转基因玉米外源BAR基因片段进行定量测定,检测范围为1.0×10~(-7) mol/L~1.0×10~(-4) mol/L,检测限为2.25×10-8 mol/L。 (2)固体石蜡作粘合剂,制得重现性好、机械强度高的碳糊电极。一定条件下十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)在电极表面自组装成紧密的单分子层,使电极表面带有大量的正电荷,进而通过静电作用将DNA固定在电极表面,以铁氰化钾[K3Fe(CN)6]和MB为指示剂对固定条件进行优化。结果表明,在弱碱性条件下,CTAB自组装膜能较好地固定ssDNA和dsDNA,而且固定的ssDNA杂交性能良好。该传感器被用于转基因油菜外源NPTⅡ(新霉素磷酸转移酶)基因片段的检测,并能识别20碱基基因片段中的2碱基错配。 (3)采用电化学氧化法使玻碳电极表面生成羧基(-COOH),以乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为偶联活化剂,分别把乙二胺和乙二醇引入电极表面作为手臂分子,延长的活性中心氨基(-NH2)或羟基(-OH)在EDC存在下可进一步有效地共价固定DNA。用循环伏安法以MB为指示剂研究固定在电极上的DNA的热变性及杂交性能。实验结果表明:手臂分子的引入,可以改善电极表面的的流体性质,有效提高DNA的固定效率以及固定的ssDNA的杂交效率。以乙二醇为手臂分子制备的ssDNA修饰电极(ssDNA/Eg/GCE)被成功地用于植物转基因工程中应用的NOS终止子(胭脂碱合成酶基因终止子)基因片段的杂交和识别。乙二胺为手臂分子制备的DNA修饰电极(DNA/En/GCE)重复性能好,可反复再生。利用微分脉冲伏安法(DPV),该DNA电化学传感器可有效地对转基因大豆NOS基因PCR扩增样品进行检测,并对存在于许多转基因植物中的花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)启动子基因片段进行了定量测定,在5.0×10-9~1.2×10~(-7) mol/L范围内,CaMV 35S启动子目标基因的浓度与MB还原峰电流的降低值呈良好的线性关系。 (4)用循环伏安法、紫外光谱法、粘度测定等方法研究双核铜配合物:丁二酮肟双核铜(II)配合物[Cu_2(hdmg)_4]和双(N-羟乙基氨乙基)草酰胺双联吡啶合铜(II)配合物[Cu_2(bpy)_2(HAO)_2~(2+)]的电化学特性,以及它们与DNA的相互作用。考察了pH、温度、配合物浓度、盐效应等因素对配合物与DNA相互作用的影响,并对配合物与DNA相互作用的机理进行了初步探讨。实验结果表明, Cu_2(hdmg)_4可与DNA的碱基结合形成非电活性物质,使溶液中自由Cu_2(hdmg)_4的浓度降低,氧化峰电流减小。ssDNA充分暴露的碱基使其与Cu_2(hdmg)_4的结合能力大于dsDNA。Cu_2(Hdmg)_4与ssDNA和dsDNA的结合比分别为2:1和1:1,结合常数分别为3.56×10~9和2.75×10~5。以Cu_2(hdmg)_4为电化学杂交指示剂成功地检测了转基因玉米外源BAR基因片段。而Cu_2(bpy)_2(HAO)_2~(2+)和DNA分子之间存在着较强的静电作用,ssDNA与配合物的相互作用比dsDNA与配合物的相互作用略强,但差别不大。Cu_2(bpy)_2(HAO)_2~(2+)和DNA分子作用后其氧还峰电流会明显降低,可利用这种性质实现对DNA的定量测定。


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