海水养殖鱼类主要细菌病多联疫苗的研制及应用

【摘要】： 随着集约化、高密度养殖的迅速发展,海水鱼类养殖业遭受各种鱼类疾病暴发的困扰,严重影响了海水养殖业的发展。其中细菌性鱼病是危害养殖鱼类的一类主要疾病,每年给水产养殖业造成重大的经济损失。多年来一直使用广谱抗生素和化学药物进行鱼类细菌病害的防治,致使病原菌的抗药性增加,且药物残留对水环境的污染日益严重,另外,药物残留还会对人体构成潜在的威胁。本论文针对海水鱼类频繁发生的细菌性疾病,进行了主要海水鱼类致病菌的优化培养、在此基础上进行了鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌多联灭活疫苗研制,并进行了多联疫苗对大菱鲆的免疫研究以及大肠杆菌表达的鳗弧菌外膜蛋白对海水养殖牙鲆的研究。 分别进行了鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌的优化培养,测定了不同温度、盐度、培养基初始pH、培养基成分配比对四种病原菌生长的影响,结果表明,鳗弧菌培养的最佳条件是:培养温度为28℃,培养盐度低于20,培养基初始pH范围在6.0～8.0。哈维氏弧菌培养的最佳条件是:温度为28℃、盐度为10～30、pH为5.0～9.0。副溶血弧菌的适宜繁殖温度为28℃、盐度为20～40、pH值为7.0～9.0。迟缓爱德华氏菌的适宜生长条件是:温度30℃、盐度10～20、pH6.0～7.0。 制备了大菱鲆常见病原菌鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌的联合疫苗,进行了大菱鲆的免疫研究。对海水养殖大菱鲆进行腹腔注射免疫,14天后用同样方法加强免疫一次,定期采血测定抗体凝集效价,70 d后分别用106-108 CFU/mL的鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌腹腔注射感染免疫鱼。结果表明在免疫7 d后大菱鲆血清中产生了四种病原菌的特异性抗体,并且在21～57 d内达到高峰,鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌的最高抗体效价分别是28.17、27.07、26.85和28.81 ,在70 d时4种菌的特异性抗体仍维持较高水平,分别是27.85、26.49、24.95和28.14。70 d时鳗弧菌、哈维氏弧菌人工感染大菱鲆的免疫保护力分别为66.67%、44.44%,而副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌感染的免疫保护力分别为20.00%和8.33%。 制备了大肠杆菌表达的致病性鳗弧菌外膜蛋白,SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子量约38kDa,Western blot分析发现表达蛋白能与鳗弧菌外膜蛋白抗体很好的反应。用不同剂量表达的鳗弧菌外膜蛋白对牙鲆进行了腹腔注射免疫研究,于28d后用鳗弧菌悬液(3.29×108CFU/ml)0.2ml对免疫牙鲆人工感染试验,结果表明用表达的鳗弧菌外膜蛋白免疫牙鲆,经人工感染后的免疫保护力分别为20.00%和33.33%。