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《中国海洋大学》 2007年
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生物修复作用菌的竞争PCR检测方法的建立及其应用

王晓熙  
【摘要】: 传统的依靠培养基进行培养、分离、生化鉴定及计数的微生物研究方法,操作繁琐、检测周期长,已远远不能满足人们对微生物快速、特异、简便、敏感且低耗的快速检测及研究的要求。近年来,微生物的快速检测和自动化研究进展迅速。快速检测及其自动化已深入到分子水平,利用核酸杂交、抗原抗体反应等对微生物进行分离、检测、鉴定和计数,使微生物的检测更为灵敏、快速、准确、方便。 竞争PCR由Gilland等[1]于1990年首先发明,其实质是用合适的内对照模板(internal control template)与待测核酸(DNA或RNA)一起竞争参与PCR反应,并通过电泳使扩增产物在凝胶上明显分开,从而进一步进行定性或定量分析。竞争PCR能消除管间及样本间的变异,定量范围较广,能够检测2倍的差异。且此方法不需要昂贵的仪器设备,实验条件容易达到。因此本论文选用竞争PCR建立了海水养殖环境生物修复作用细菌的快速定量检测方法。 竞争PCR定量方法的关键是内标,内标设计成功与否直接影响竞争PCR反应。本文通过将细菌特定DNA片段经双酶切缺失中间一小片段,将余下的2个较大片段连接,并用相同的引物在相同条件下扩增连接产物,从而获得截短的同源性片段,作为内标。制备时,将其纯化后克隆于pMD18-T载体,重组质粒经酶切和PCR鉴定,验证无误后作为竞争性模板内对照。将内标模板按一定比例稀释后分别与等体积细菌DNA进行PCR,结果表明目的DNA与竞争性DNA的扩增产物之间具有明显的线性竞争关系,结合其他细菌计数方法,建立了内标模板量与原样品中细菌数量的线性方程。本实验设计的特异性引物经PCR扩增得到了与预期PCR产物大小相当的特异性条带且敏感性较好。本竞争PCR方法的灵敏度可达到100. 5ng/μL,检测时间从平板计数需花3-5天到只需2天即能完成,大大提高了检测速度,节省了大量的时间和试剂,并且可以定量检测特定的细菌。 在建立了竞争PCR定量检测方法后,我们应用此方法检测了2006年冬季和2007年春季浙江象山港海湾网箱养殖区沉积环境中这两类菌的分布情况,五个区域分别为网箱养殖区、贝类养殖区、海带养殖区、离网箱较近的对照区、离网箱较远的对照区。检测结果表明,无论在春季样品中还是冬季样品中菌株Y都比菌株J_3多一个或两个数量级;在五个区域中网箱养殖区菌量最大,春季样品中J_3菌量为1.47×10~4个/g,Y菌量为4.59×10~4个/g;但同一区域春季与冬季相比,除离网箱较远的对照区外,同一区域J_3菌春季比冬季要多出一个数量级。Y菌除了海带养殖区可看出增加外,其余几个区域并没有明显增加。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q93-3

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 董旭南,段新华,张向阳;PCR技术常见疑难浅析及策略[J];草食家畜;2002年01期
2 帅小蓉,夏庆友,朱勇;定量PCR技术的研究现状及应用概述[J];蚕学通讯;2002年04期
3 徐丽美,王玮,杨丰;对虾白斑杆状病毒(WSBV)定量PCR检测技术研究[J];高技术通讯;2001年01期
4 徐丽美,杨丰;利用定量PCR方法研究对虾白斑杆状病毒感染与发病的关系[J];高技术通讯;2001年12期
5 马军,邱立平,冯琦;聚合酶链式反应在微生物检测中的应用[J];中国给水排水;2002年01期
6 汪荣泉;竞争性PCR定量检测病毒基因的研究进展[J];国外医学(流行病学传染病学分册);1995年03期
7 林玲;定量PCR技术的研究进展[J];国外医学.遗传学分册;1999年03期
8 张洁梅;食品微生物检验技术的研究进展[J];现代食品科技;2005年02期
9 张元颖,何农跃,陆祖宏;基因芯片的PCR引物设计[J];化工时刊;2002年07期
10 席海燕,蔡强,何苗,施汉昌;污水中大肠杆菌的酶联免疫检测方法研究[J];环境科学;2005年05期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 谢永芳,舒坤贤,梁亦龙,袁帅,张继承;小鼠胚胎发育中期肠细胞增殖与凋亡的研究[J];癌变.畸变.突变;2005年01期
2 王子良,许丽艳,李恩民;质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响[J];癌变.畸变.突变;2005年02期
3 康振桥;季艳霞;杨志勇;苏光;崔彦芝;;血管内皮生长因子亚型在人乳腺癌细胞中的表达差异[J];癌变.畸变.突变;2006年03期
4 安刚;黄天华;谢庆东;王德刚;;pCXN2-mIZUMO对C57BL/6小鼠生育能力的影响[J];癌变.畸变.突变;2007年04期
5 朱斌;杨罗艳;赵晓昆;;膀胱癌多药耐药基因MDR-1与金属硫蛋白-3表达的关系[J];癌变.畸变.突变;2007年05期
6 杨超;孙秀东;;应用RT-PCR检测辣椒上的黄瓜花叶病毒[J];山东农业科学;2009年02期
7 毕玉平,廖俊杰,单雷,王兴军,徐平丽;番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究[J];山东农业科学;1997年06期
8 单雷,毕玉平,王兴军,徐平丽,李广存;双抗TMV和CMV转基因番茄后代的遗传分析[J];山东农业科学;1998年04期
9 葛宏华,孙莉宁,张其瑞;家蚕血淋巴蛋白的发育变化和BmLSP的纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);2001年03期
10 王北艳;曹宁;汤晖;;苜蓿中华根瘤菌电转条件的优化[J];安徽农学通报;2008年11期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 肖国华;高晓田;赵振良;张立坤;陈力;张兵;;白洋淀网箱养殖环境微生物原位修复技术研究[A];第二届全国现代生态渔业可持续发展论文集[C];2010年
2 庄金秋;梅建国;沈志强;;鸡贫血病毒实验室诊断方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 王春花;成军;郎振为;吴煜;杨艳杰;张黎颖;刘妍;;基因表达谱芯片技术筛选XTP3蛋白反式调节基因[A];第一届全国人工肝及血液净化学术年会暨全国人工肝及血液净化攻关协作组成立大会论文集[C];2004年
4 唐南洪;王晓茜;李秀金;陈燕凌;;构建特异高表达人谷氨酰胺合成酶基因(hGS)的肝细胞[A];第三届全国重型肝病及人工肝血液净化学术年会论文集(上册)[C];2007年
5 沈文英;李卫芬;徐正海;;益生菌对三角帆蚌生长和免疫酶活性的影响[A];全国畜禽和水产养殖污染监测与控制治理技术交流研讨会论文集[C];2008年
6 尹艳娥;沈新强;全为民;;养殖池塘底泥反硝化菌修复的室内比较实验[A];有毒化学污染物监测与风险管理技术交流研讨会论文集[C];2008年
7 马丽萍;程须珍;张辉;;野生绿豆种质资源TC1966抗豆象基因的AFLP标记研究[A];2005年全国作物遗传育种学术研讨会暨中国作物学会分子育种分会成立大会论文集(二)[C];2005年
8 尹艳娥;沈新强;晁敏;;反硝化技术对养殖池塘修复的研究[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第三卷)[C];2010年
9 陈信忠;任聪;龚艳清;王寿昆;;实时荧光定量PCR法检测对虾白斑综合征病毒[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第三卷)[C];2010年
10 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
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1 王丽燕;面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)对中国卤虫(Artemia sinica)抗弧菌感染的影响与酚氧化酶原在卤虫早期发育过程中表达时相的研究[D];中国海洋大学;2010年
2 赵珺;高温热应激环境对雄性小鼠生殖机能影响及其分子机理的研究[D];东北师范大学;2010年
3 李林杰;生态高值农业技术创新模式研究[D];湖南农业大学;2010年
4 刘通;阳极氧化预处理铝基体新型涂层的制备及其海洋防腐防污功能的研究[D];中国海洋大学;2011年
5 刘瑞;副溶血弧菌丝氨酸蛋白酶及溶血素的表达、纯化、定点突变及弧菌多联DNA疫苗的研制[D];中国海洋大学;2011年
6 陈文宾;微生物固定化技术在室内养殖海水净化中的应用研究[D];中国矿业大学;2010年
7 刘问;白斑综合征病毒对锯缘青蟹的致病性及致病机理研究[D];宁波大学;2010年
8 赵志平;光合细菌Rhodobacter sphaeroides新型异源蛋白表达体系的构建及其应用研究[D];重庆大学;2011年
9 魏朝明;中国螽(虫斯)总科昆虫的RAPD分析研究[D];陕西师范大学;2000年
10 贾永清;表达禽流感病毒HA基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D];东北农业大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 赵巧玲;植物浮床对精养池塘水质及浮游藻类群落结构的效应[D];华中农业大学;2010年
2 贺中华;黄鳝肠道菌群的初步分析和益生菌的开发与应用研究[D];华中农业大学;2010年
3 孟小亮;黄颡鱼肠道益生菌的筛选及其应用研究[D];华中农业大学;2010年
4 肖犟;PRRSV对断奶仔猪生产性能和免疫力相关指标的影响[D];华中农业大学;2010年
5 项宜娟;纤维床固定化酪丁酸梭菌产丁酸的研究[D];浙江理工大学;2010年
6 张萍;电离辐射对人外周血细胞GADD45A和nm23-H1基因表达的影响[D];郑州大学;2010年
7 李超;安徽地区猪圆环病毒2型的流行病学调查及地方株的特性研究[D];安徽农业大学;2010年
8 闫法军;刺参养殖池塘有机物降解微生物的分离筛选及其特性研究[D];中国海洋大学;2010年
9 杨成业;产蛋白酶菌株HW08的鉴定及其所产胞外低温碱性蛋白酶Ps5的性质研究[D];中国海洋大学;2010年
10 刘君;对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果[D];中国海洋大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 姚敬业,金庆;1996年发生在日本的大肠菌0_(157)食物中毒[J];安徽预防医学杂志;2000年01期
2 杨圣辉,果梅英,刘颖,陈威,张辉;龋活性试验——变形链球菌附着板方法的研究[J];北京口腔医学;1999年04期
3 王建秋,肖白,李昌义,刘敬忠;聚合酶链反应检测同源性变形链球菌[J];北京口腔医学;2000年02期
4 于伟君,姚福相,侯玉成,钟伟;光合细菌在对虾养殖中应用的初步试验[J];水产科学;1991年01期
5 安树升,胡守义,万劲,王建芳;光合细菌培育海湾扇贝幼体的生产试验[J];水产科学;1996年03期
6 王鉴, 祝国芹;不同浓度的光合细菌对轮虫繁殖的影响[J];水产科学;1994年05期
7 赵翠燕,崔恒敏;禽流感检测方法研究进展[J];山东家禽;2003年01期
8 旷铁平,段建平,李惠民;荧光定量PCR在单疱病毒角膜炎诊断中的应用[J];中国医师杂志;2001年09期
9 伊玉华,南春华;光合细菌在对虾养殖上的应用[J];大连水产学院学报;1990年01期
10 肖鹏峰,何农跃,朱纪军,徐吉庆,陆祖宏;分子印章法DNA芯片的合成(Ⅰ)——PDMS印章的固定与收缩研究[J];东南大学学报(自然科学版);2001年02期
【相似文献】
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1 高蓝,李浩明;表面展示技术在污染环境生物修复中的应用[J];应用与环境生物学报;2005年02期
2 陈翠柏,杨琦,沈照理;地下水三氯乙烯(TCE)生物修复的研究进展[J];华东地质学院学报;2003年01期
3 陈熹兮,李堃宝,李道棠;低温微生物及其在生物修复领域中的应用[J];自然杂志;2001年03期
4 喻龙,龙江平,李建军,冯慕华,郝玉;生物修复技术研究进展及在滨海湿地中的应用[J];海洋科学进展;2002年04期
5 陶颖,周集体,王竞,严滨;有机污染土壤生物修复的生物反应器技术研究进展[J];生态学杂志;2002年04期
6 李法云,臧树良,罗义;污染土壤生物修复技术研究[J];生态学杂志;2003年01期
7 刘宪华,冯炘,宋文华,戴树桂;假单胞菌AEBL3对呋喃丹污染土壤的生物修复[J];南开大学学报(自然科学版);2003年04期
8 李颖,贾丽娜,张鹏;高效生物修复菌株的筛选及其降解能力的研究[J];化工环保;2004年S1期
9 马瑛,张甲耀,侯祖军,夏盛林,李静;堆肥化生物修复技术处理有毒有害固体废弃物的模拟研究[J];环境科学;1997年04期
10 王真辉,林位夫;农田土壤重金属污染及其生物修复技术[J];海南大学学报(自然科学版);2002年04期
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1 杨辉;范宝山;李小平;;河流的生物修复[A];中国河道治理与生态修复技术专刊[C];2009年
2 陈声明;王永维;;微生物在生态保护与生物修复中的地位和作用[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
3 黄彩娣;王燕锋;陈红萍;;上海公园富营养化景观水体的生物修复试验研究[A];上海市风景园林学会论文集[C];2005年
4 伍钧;谭小琴;;重金属污染土壤的生物修复[A];第七次“土壤与环境”学术研讨会论文摘要[C];2001年
5 杨建刚;刘翔;;多环芳烃污染土壤的生物修复机理研究[A];第七次“土壤与环境”学术研讨会论文摘要[C];2001年
6 王崇臣;黄忠臣;;盆栽农作物对铅、镉的富集作用研究[A];第二届重金属污染监测风险评价及修复技术高级研讨会论文集[C];2008年
7 何丽媛;唐霞;党志;易筱筠;;高效石油降解菌群的构建及降解特性的研究[A];第五届全国环境化学大会摘要集[C];2009年
8 曲宝成;周集体;;土壤中C.I.Acid Red 14的联合生物修复研究[A];第五届全国环境化学大会摘要集[C];2009年
9 谢响明;何晓青;陈晓阳;;白腐菌对有机污染物的降解和生物修复研究进展[A];中国菌物学会第三届会员代表大会暨全国第六届菌物学学术讨论会论文集[C];2003年
10 杜鹏;于典司;郭长虹;;室内空气污染与甲醛生物修复[A];东北三省及内蒙古地区遗传学研究进展学术研讨会论文汇编[C];2009年
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1 本报记者 林菲;“生物修复工程”为土壤解毒[N];农民日报;2001年
2 牛 虹;生物修复科技与美容[N];中国质量报;2004年
3 本报记者 李青滨;处理原油污染 生物修复大有可为[N];中国海洋报;2010年
4 冯亦珍、朱星华;长江口利用生物修复河口生态[N];人民日报;2003年
5 李凯;地科院水环所生物修复油污土壤[N];地质勘查导报;2009年
6 李凯;中原油田试验生物修复油污土壤[N];中国国土资源报;2009年
7 本报记者 倪国和;放流中华鲟等生物修复河口生态系统[N];文汇报;2001年
8 本报记者 周清春;神奇的科技这样改变我们的生活[N];科技日报;2005年
9 黄喜祖;志在碧海锁“赤龙”[N];中国渔业报;2005年
10 记者 王晓涛;我国研制成功国际领先的有机磷农药降解酶制剂[N];中国经济导报;2006年
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1 刘大丽;谷胱甘肽合成相关酶在重金属污染生物修复中的分子机制及比较研究[D];东北林业大学;2013年
2 唐先进;固废拆解地区农田土壤多氯联苯污染调查与生物修复研究[D];浙江大学;2011年
3 程国玲;矿物油污染土壤的菌根生物修复研究[D];东北林业大学;2004年
4 刘立丽;污染环境中~(95)Zr和耐辐射奇球菌的研究[D];浙江大学;2004年
5 袁秀堂;刺参Apostichopus japonicus(Selenka)生理生态学及其生物修复作用的研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2005年
6 肖潇;基于镉超累积植物内生菌的重金属污染修复研究[D];湖南大学;2011年
7 刘娜;地下水中阿特拉津污染的原位生物修复研究[D];吉林大学;2006年
8 付晚涛;繁茂膜海绵生物修复和生物监测近海养殖水体的可行性研究[D];中国科学院研究生院(大连化学物理研究所);2006年
9 张文;应用表面活性剂强化石油污染土壤及地下水的生物修复[D];华北电力大学;2012年
10 杨万勤;土壤生态退化与生物修复的生态适应性研究[D];西南农业大学;2001年
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1 李颖;石油污染土壤的生物修复[D];北京化工大学;2004年
2 刘苓;石油污染土—水系统的生物修复研究[D];大庆石油学院;2010年
3 沈淑芬;海带的生物修复作用及无性繁殖系的建立[D];福建师范大学;2013年
4 鹿玲;西北黄土石油污染生物修复影响因素的研究[D];兰州理工大学;2013年
5 方云;堆肥法生物修复多环芳烃污染土壤[D];西南大学;2010年
6 冯美霞;菊花心江蓠对富营养化海水的生物修复研究[D];福建师范大学;2011年
7 袁杰;水库污染沉积物生物修复[D];西安建筑科技大学;2010年
8 陈婷;Sphingobium indicum B90A降解六六六的特性及其对污染土壤的生物修复[D];南京农业大学;2012年
9 倪娜;降解柴油酵母菌的分离纯化及性质研究[D];曲阜师范大学;2011年
10 胡文稳;固定化微生物对原油污染土壤的生物修复[D];中国海洋大学;2010年
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