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转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除

张晓青  
【摘要】: 本论文研究是在臧晓南博士构建的转牙鲆生长激素基因集胞藻基础上进行的。转牙鲆生长激素集胞藻通过鱼类生长因子在饵料生物体内表达,能够明显促进鱼类的生长,可以被用来开发新型鱼类饵料添加剂。成功构建转基因藻之后,实现高密度培养是转基因集胞藻能否走向应用的关键环节之一。 卡那霉素抗性基因在转基因集胞藻的转化中起标记基因作用,牙鲆生长因子基因已经在集胞藻中稳定存在,不需要卡那霉素抗性基因在生产中再作为选择标记,因此可以通过基因剔除将卡那霉素抗性基因从转基因集胞藻中敲除,彻底的消除卡那霉素抗性基因的影响。 本实验研究了培养及组成、培养温度、光照强度等培养条件对转牙鲆生长激素基因集胞藻生长的影响。通过研究培养基中硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐对转牙鲆生长激素基因的集胞藻生长影响的单因子实验,得到NaNO3适宜浓度范围是1.0~1.5 g/L,K2HPO4适宜范围是0.04~0.06g/L。Na2CO3适宜范围是0.02~0.04g/L。然后再对以上3个营养因子进行三水平的正交实验,得到培养基中硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐的优化组合:NaNO3 1.25g/L,K2HPO4 0.04 g/L,Na2CO3 0.04g/L (其它同BG-11培养基)。在培养基中营养盐优化基础上,对培养温度、光照强度、pH值进行三因素三水平的正交实验,以确定最适的培养条件。实验结果表明,转基因集胞藻在30℃,光照强度60μmol·m-2·s-1,pH值8培养条件下,藻细胞的生物量得到有效提高,特定生长速率达到20.64,这为转牙鲆生长激素基因集胞藻在生产应用中高密度放大培养提供了依据。 在本实验室已经构建的质粒pZGH基础上,包括集胞藻的同源片断groESL,isiAB启动子(promoter),牙鲆生长激素基因(gh)和卡那霉素抗性基因,根据卡那霉素抗性基因两端的序列,用限制性内切酶NotΙ和XhoΙ双酶切,获得含有同源重组位点groESL而不含卡那霉素抗性基因的质粒。再利用转基因集胞藻卡那霉素抗性基因两侧设计双交换同源重组位点,采用自然转化方法,将抗性基因从转基因集胞藻中去除。


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