海蜇口腕部糖蛋白理化性质及生物活性研究

【摘要】： 海蜇(Rhopilema esculehtum Kishinouye)是一种大型的食用水母,在我国有着广泛的资源分布,具有很高的经济价值、营养价值和药用价值。近代研究表明海蜇有治疗高血压、慢性气管炎、哮喘、胃溃疡和单纯性甲状腺肿大等作用。从海蜇的营养保健及药学功能来看,海蜇具有进一步开发和利用的价值。目前,海蜇的一些化学成分及生物活性已经被研究探讨,如蛋白,毒素,多肽和糖胺聚糖等,但关于海蜇口腕部糖蛋白的研究未见报道。 本论文以青岛附近黄海海域的新鲜海蜇为原料,采用现代的分离纯化技术,仪器分析技术,药理研究技术和分子生物学技术,从海蜇口腕部分离纯化出一种新的糖蛋白(JGP-Ⅲ),并对其理化性质,清除自由基活性,免疫活性进行研究,旨在为海蜇资源的进一步开发提供理论依据和技术支持。实验主要获得如下研究结果: 1利用单因素实验和响应面分析方法中的Box-Behnken试验设计,对海蜇口腕部糖蛋白的提取工艺进行优化,结果显示,糖蛋白提取的最佳工艺条件为:提取溶剂为pH值为7.26的PBS,料液比为1:4,提取时间为7h。在此基础上。进行超声辅助提取,提取的最佳工艺条件是:超声处理时间为15min,超声功率为300W,提取时间60min。在此优化条件下,目标糖蛋白的得率为9.14%。 2海蜇口腕部提取液经乙醇分级沉淀,Sp Sephadex C-25阳离子交换柱层析初步分离,得到3组份,分别为JGP-Ⅱ, JGP-Ⅲ, JGP-Ⅳ,选择糖和蛋白含量及活性较高的组分JGP-Ⅲ进行进一步研究。JGP-Ⅲ经Sephacryl S300HR层析柱, Sepharose CL-6B柱层析和HPLC鉴定JGP-Ⅲ呈现单一对称的峰;经SDS-PAGE电泳后,通过PAS和考马斯亮兰两种染色方法,在凝胶上相应的位置出现了一条带。以上结果显示JGP-Ⅲ是组成均一的糖蛋白,而不是糖和蛋白的混合物。得率为0.5%(占海蜇口腕部干基重)。 3 JGP-Ⅲ冻干粉是白色絮状粉末,易溶于水,不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂。经化学分析方法测定,JGP-Ⅲ中含有12.61%总糖,74.34%总蛋白,8.47%氨基糖,0.84%糖醛酸,1.06%硫酸根、0.92%唾液酸。JGP-Ⅲ经SDS-PAGE测定分子量为109.7kDa,经HPLC测定,其分子量为85.3 kDa,两种方法测定得到的分子量有一定差别。JGP-Ⅲ的Td值为31.06℃,Ts值为61.74℃。JGP-Ⅲ的单糖组成主要有氨基葡萄糖,氨基半乳糖,葡萄糖,甘露糖,岩藻糖和鼠李糖。氨基酸组成中甘氨酸含量最高,其次为缬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天门冬氨酸等,缺乏色氨酸和组氨酸。JGP-Ⅲ经消除反应前后紫外吸收和氨基酸组成的变化,说明JGP-Ⅲ中有O-连接糖苷键的存在。经糖肽酶F作用后,分子量发生明显变化,说明JGP-Ⅲ中有N-连接糖苷键的存在。JGP-Ⅲ的红外图谱具有典型的糖蛋白特征,再次证明JGP-Ⅲ是一种糖和蛋白的复合物。NMR图谱显示了JGP-Ⅲ结构特点。以上结果显示JGP-Ⅲ是一种新的糖蛋白,这为JGP-Ⅲ的进一步研究提供理论依据。 4试验通过化学发光的方法,检测JGP-Ⅲ具有较强的清除羟自由基和超氧自由基能力。JGP-Ⅲ的由糖部分和蛋白部分共同参与清除自由基活动;在清除自由基活动中,N-连接的寡糖链起到主要的作用;当温度达到热收缩温度61.74℃(即蛋白纤维收缩到原来的1/3)时,清除自由基能力最强,说明JGP-Ⅲ清除自由基活性与其空间三维结构有密切关系。 5采用JGP-Ⅲ溶液灌胃免疫低下模型小鼠,探讨了JGP-Ⅲ免疫调节功能。结果表明,不同剂量组的JGP-Ⅲ均能提高小鼠脾指数及胸腺指数(P0.05);显著提高荷瘤小鼠血清溶血素含量(P0.01)和抗体形成细胞数(P0.05);提高迟发型变态反应;促进巨噬细胞的吞噬能力(P0.05,P0.01)。提示JGP-Ⅲ能全面调节机体的特异性和非特异性免疫功能,从而提高机体免疫能力。 6用MTT法检测了JGP-Ⅲ对从小鼠的脾脏细胞中分离的淋巴细胞的增殖活性的影响,结果发现,JGP-Ⅲ可以促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖活性,并且主要是通过对T淋巴细胞群起作用的,而对B淋巴细胞几乎没有影响。JGP-Ⅲ作用的最佳浓度为50μg/ml。进一步通过RT-PCR方法研究了JGP-Ⅲ对T淋巴细胞分泌的细胞因子IL-2, IL-4, IL-6和IFN-γ的影响,结果显示:细胞内的IL-2和IFN-γ的mRNA水平很快升高,而对IL-4和IL-6的作用则相对较慢,说明JGP-Ⅲ对T淋巴细胞的作用主要是作用于Thl亚细胞群。从细胞水平上揭示了JGP-Ⅲ免疫调节作用的途径。